تقييم التهاب القولون الناجم عن المواد الكيميائية عن طريق التحليل الكيميائي المناعي لأقسام أنسجة القولون

الملخص

المصدر: Du ، Y. W. et al. ، تأثيرات إلغاء بروتين إشارات التذوق على التهاب الأمعاء في نموذج فأر مرض التهاب الأمعاء.J. Vis. Exp.(2018)

يوضح هذا الفيديو تقييم التهاب القولون الناجم عن المواد الكيميائية عن طريق تلطيخ الأنسجة الهيستوكيميائية المناعية لأنسجة القولون في الفأر. في قسم الأنسجة الملطخة ، يمثل وجود عدد كبير من الخلايا المستجيبة للمناعة في الأنسجة التالفة تسلل الخلايا المناعية أثناء التهاب القولون.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحضير الفئران و DSS

1. احتفظ بالضربة القاضية (α-gustducin ^-/-) الفئران والتحكم من النوع البري المطابق للعمر والجنس ووزن الجسم (α-gustducin ^+/+) C57BL / 6 بشكل فردي في أقفاص نظيفة.
   ملاحظه: تم تهجين الفئران بالضربة القاضية مع الفئران C57BL / 6 لأكثر من 20 جيلا ولديها خلفية وراثية C57BL / 6 بنسبة 100٪ تقريبا.
2. قم بإذابة 30 جم من مسحوق كبريتات ديكستران الصوديوم (DSS) في 1 لتر من الماء المعقم. امزج حتى يصبح المحلول واضحا للتأكد من أن تركيز العمل النهائي هو 3٪ (وزن / حجم).
   ملاحظه: يمكن تخزين محلول DSS في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى أسبوع واحد أو عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.

< p class = "jove_title" >2. تحريض وتقييم التهاب القولون DSS في الفئران

1. قم بوزن وتسجيل وزن الجسم الأولي لكل فأر. ضع الفئران بشكل فردي في أقفاص بلاستيكية قياسية وقم بتسمية الأقفاص.
2. استبدل مياه الشرب العادية بمحلول DSS بنسبة 3٪ لمدة 7 أيام يمكن لكلتا المجموعتين من الفئران الوصول إليها بشكل خاص.
3. قم بقياس وزن جسم الماوس ، وتسجيل استهلاك محلول DSS ، وجمع وفحص براز كل فأر يوميا أثناء إدارة DSS. لاحظ شدة الإسهال ونزيف المستقيم وقم بتحويله إلى مؤشر المرض الناجم عن DSS.
4. أثناء التجربة ، يتم حساب النسبة المئوية لفقدان الوزن مقارنة بالوزن الأولي ومؤشر المرض لتقييم أعراض التهاب القولون.
   ملاحظه: يتم تسجيل مؤشر المرض من خلال الجمع بين ملاحظات الإسهال ونزيف المستقيم ويتم تعريفه على النحو التالي: 0 (براز طبيعي ، بدون دم) ، 1 (براز ناعم ، بدون دم) ، 2 (براز ناعم ، قليل من الدم) ، 3 (براز ناعم جدا ، نزيف متواضع) ، و 4 (براز مائي ، نزيف حاد). يتم تحليل مؤشر المرض يوميا لكل فأر.
5. بحلول نهاية علاج DSS لمدة 7 أيام ، ضحي بالفئران عن طريق خلع عنق الرحم واستمر في التجارب المتبقية.

< p class = "jove_title" >3. تحضير عينات الأنسجة

1. ضع الفأر في وضع ضعيف ونظف جلد البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول. قم بعمل شق خط الوسط بطول 3 سم في البطن بمقص صغير لكشف تجويف البطن.
2. استخدم زوجا من الملقط لفصل الطحال بعناية عن الأنسجة الأخرى ، ثم قم بإزالة الطحال وقياس حجمه.
3. تحديد القولون وارفعه بالملقط وفصله عن المساريق المحيط. اسحب القولون بالكامل حتى يظهر الأعور والمستقيم.
4. اعزل القولون عن طريق تحويله إلى هامش القولون وعمق الحوض لتحرير القولون القريب والبعيد ، على التوالي. ثم قم بقياس وتسجيل طول القولون المعزول. احرص على عدم إتلاف أنسجة القولون أثناء إجراء التشريح.
5. اغسل القولون ب 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات المثلج (PBS) باستخدام حقنة سعة 10 مل مزودة بإبرة تزقيم لإزالة البراز والدم حتى يصبح الشطف صافيا تماما.
6. لتحديد النسيجية ، قسم عينات الأنسجة بالتساوي إلى ثلاثة أجزاء: القريبة والوسطى والبعيدة. بعد ذلك ، قم بإصلاح الأنسجة بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
7. لتحليل تعبير السيتوكين ، قم بتجميد القولون بالكامل بسرعة باستخدام النيتروجين السائل وتخزينه عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

4. التقييم النسيجي لشدة التهاب القولون الناجم عن DSS

1. الكيمياء المناعية
   1. بعد التثبيت ، اغمر الأنسجة في محلول من 30٪ سكروز في 1x PBS طوال الليل في أنبوب سعة 15 مل لحماية العينات بالتبريد.
   2. قم بتضمين الأنسجة في مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) وضعها عند -20 درجة مئوية حتى تصلب OCT.
   3. انقل كتلة OCT التي تحتوي على الأنسجة إلى ناظم التبريد ، واضبط قرص السماكة في ناظم البرد على 12 ميكرومتر ، وقم بتقطيع وجمع الأقسام المجمدة بسمك 12 ميكرومتر.
   4. قم بتسخين أقسام الأنسجة المجمعة من ناظم البرد عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على لوح ساخن. اغسل الأقسام في 1x PBS 3 مرات ، لمدة 10 دقائق لكل منها. احتضان أقسام الأنسجة في بيروكسيد الهيدروجين 3٪ لمدة 10 دقائق للتخلص من البيروكسيديز الداخلي. اغسل الأقسام 3 مرات أخرى. قم بسد الأنسجة باستخدام المخزن المؤقت المانع (3٪ ألبومين مصل البقر (BSA) ، 0.3٪ منظف غير أيوني ، 2٪ مصل الماعز ، 0.1٪ أزيد الصوديوم في 1x PBS) في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة أو أكثر.
   5. استبدل المخزن المؤقت المانع بمحلول يحتوي على الأجسام المضادة الأولية التالية الخاصة بنوع الخلايا المناعية: CD45 للكريات البيض ، CD3 للخلايا التائية ، B220 للخلايا البائية ، CD11b للضامة ، و Ly6G للعدلات. احتضن عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
   6. إزالة الأجسام المضادة الأولية من أقسام الأنسجة عن طريق الشفط. اغسل الأقسام ب 1x PBS 3 مرات ، لمدة 10 دقائق لكل منها. احتضان الأقسام بجسم مضاد ثانوي بيوتينيل متبوعا بحضانة مركب الستربتافيدين-HRP في درجة حرارة الغرفة.
   7. احتضان الأقسام بمحلول 3،3 '-diaminobenzidine (DAB) لتطوير لون بني فاتح أو غامق وتصور الخلايا المناعية.
   قم بإزالة
   8. البقع المضادة للأقسام التي تحتوي على الهيماتوكسيلين و 0.3٪ (v / v) الأمونيا المخففة. التقط صورا للمجال الساطع بتكبير 10 أضعاف تحت المجهر.
   9. استخدم برنامج معالجة الصور لتحديد وتحديد عدد الخلايا المناعية الملحوظة في كل من الظهارة والصفيحة المخصوصة (أسفل الظهارة) عن طريق وضع قناعين: استخدم القناع الأول في الميزة القائمة على مكعب الألوان لتعيين عتبة اكتشاف اللون وقياس المناطق الملونة التفاعلية ل DAB ؛ استخدم القناع الثاني لتحديد المساحات الإجمالية للظهارة والصفيحة الصفيحية في القسم الذي تم فحصه. عبر عن عدد الخلايا المناعية كنسبة من منطقة تلطيخ الخلايا المتسللة إلى المساحة الإجمالية للأنسجة التي تم فحصها.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات جسم سي دي 45 BD Biosciences 550539 CD3 BD Biosciences 555273 ب 220 BD Biosciences 550286 CD11b BD Biosciences 550282 لاي 6 جي BD Biosciences 551459 الكاشف ديكستران كبريتات ملح الصوديوم (DSS) MP الطب الحيوي 2160110 مركب Streptavidin-HRP BD Pharmingen 551011 محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) سانغون للتكنولوجيا الحيوية B548117 د.ب 10 مل حقنة BD Biosciences 309604 الأدوات والمعدات توازن مقص ملقط تلطيخ الجرار برمجيات Imag-Pro Plus ميديا سايبرنتيكس ، إنك.