قتل خلايا K562 بواسطة خلايا الدم المحيطية أحادية النواة المعرضة لمستحضرات منتجات التبغ

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Arimilli، S. et al.، طرق لتقييم السمية الخلوية وتثبيط المناعة لمستحضرات منتجات التبغ القابلة للاحتراق. J. Vis. Exp. (2015)

في هذا الفيديو ، ندرس تأثير وسط كامل مكيف بالدخان ، وهو مستحضر منتج التبغ القابل للاحتراق ، على قتل خلايا K562 بواسطة خلايا الدم المحيطية أحادية النواة المستجيبة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. K562 فحص القتل

< p class = "jove_content" >ملاحظة: يجب زراعة خلايا K562 في الثقافة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ مع وسط RPMI كامل حتى تصل إلى 80٪ من التقاء قبل الفحص.

1. قم بإعداد محلول مخزون 5 ملي مولار من الكربوكسي فلوريسين سوكسينيميديل إستر (CFSE) عن طريق إضافة 18 ميكرولتر من DMSO إلى القارورة.
2. قم بتخفيف WS-CM أو النيكوتين في صفيحة سعة 96 بئرا باستخدام متوسط RPMI كامل إلى حجم إجمالي يبلغ 100 ميكرولتر / بئر لتحقيق وحدات النيكوتين المتساوية أو تركيزات النيكوتين المطلوبة لكل بئر.
   أنذر: النيكوتين سام للغاية وخطير بيئيا.
3. أضف 100 ميكرولتر من PBMCs إلى وسط RPMI الكامل بتركيز 1.5 × 10⁶ خلايا / بئر. سيكون الحجم الإجمالي للخلايا التي تحتوي على WS-CM أو النيكوتين 200 ميكرولتر / بئر.
4. غطي الطبق واحتضنه لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
5. اغسل خلايا K562 بإضافة 10 مل من DPBS وأجهزة الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 8 دقائق في RT.
6. أعد تعليق الخلايا ب 10 مل من DPBS وعد خلايا K562.
7. قم بإعداد حل عمل CFSE عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من محلول مخزون CFSE إلى 1 مل DPBS.
8. أضف 1 مل من محلول عمل CFSE إلى 1 مل من تعليق الخلية K562 الذي يحتوي على 1-2 × 10⁷ خلايا. دوامة واحتضان بدقة لمدة 2 دقيقة في RT.
9. أضف على الفور 200 ميكرولتر من FBS. دوامة واحتضان بدقة لمدة 2 دقيقة في RT.
10. أضف 10 مل من الوسط الكامل RPMI وقم بالطرد المركزي للأنبوب عند 400 × جم لمدة 8 دقائق في RT.
11. قم بإزالة المادة الطافية RPMI ، وكسر الحبيبات ، وأعد تعليق الخلايا ب 10 مل من الوسط الكامل RPMI ، واحسب خلايا K562 المسمى CFSE.
12. اغسل PBMCs عن طريق الطرد المركزي للوحة عند 300 × جم لمدة 3 دقائق في RT. قم بشفط المادة الطافية عن طريق صب السائل. استبدل الغطاء وقم بدوامة الجزء السفلي من اللوحة. أضف 200 ميكرولتر من RPMI الكامل المتوسط وكرر خطوة الغسيل مرة أخرى.
13. أضف خلايا K562 المسماة CFSE بنسبة 1:15 (100,000 K562s: 1.5 × 10⁶ PBMCs) إلى كل بئر عينة من لوحة PBMC واحتضانها لمدة 5 ساعات عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
14. اغسل مزيج الخلية عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 3 دقائق في RT. قم بشفط المادة الطافية عن طريق التخلص من السائل. ضع الغطاء وقم بدوامة الجزء السفلي من اللوحة.
15. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتشغيل وكرر خطوة الغسيل الموضحة في الخطوة 14 مرة أخرى.
16. أضف 95 ميكرولتر من المخزن المؤقت قيد التشغيل متبوعا ب 5 ميكرولتر من 7AAD لكل بئر لحجم إجمالي يبلغ 100 ميكرولتر / بئر. احتضن الطبق في الظلام في RT لمدة 15 دقيقة.
17. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت الجاري إلى كل بئر وانقل الحجم الكامل لتعليق الخلية من كل بئر من اللوحة إلى الأنابيب العنقودية واحصل على العينات الموجودة على مقياس التدفق الخلوي.
18. تحديد النسبة المئوية للخلايا الإيجابية ل 7AAD والخلايا الإيجابية ل CFSE باستخدام برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 12 × 75 أنبوب بي دي فالكون 352058 15 مل أنابيب مخروطية الشكل كورنينج هاتف: 430790 2 مل الأنابيب الدقيقة أكسايجن MCT-150-C-S 50 مل أنابيب مخروطية الشكل كورنينج 430828 زجاجة 500 مل كورنينج 430282 7 د. BD Pharmingen 559925 96 بئر لوحة مسطحة القاع تيرمو نونك 439454 96 بئر ألواح سفلية مستديرة بي دي فالكون 353077 غطاء مزرعة الخلية الترمو: العلمية 1300 السلسلة A2 الطرد المركزي إيبندورف 58110 ص CFSE تقنيات حياة المجسات الجزيئية سي 34554 أنابيب العنقودية كورنينج 4401 ضار إذا ابتلع ، مادة مسرطنة DMSO (ثنائي ميثيل سلفوكسيد) سيجما ألدريتش د8418 DPBS لونزا 17-512 فهرنهايت FBS سيجما ألدريتش F2442 وحدة التصفية نالجين 156-4020 مقياس التدفق الخلوي BD Biosciences FACS كانتو II 8 ألوان عند Ex 405 نانومتر و Em785 نانومتر. مقياس التدفق الخلوي BD Biosciences FACS كاليبور 4 ألوان في Ex 495 نانومتر و Em 785 نانومتر. برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي نجمة الشجرة فلولجو نيكوتين سيجما ألدريتش N3876 السمية الحادة ، المخاطر البيئية بارافيلم بيميس "م" بارافورمالدهيد سيجما ألدريتش ص 6148 قابل للاشتعال ، تهيج الجلد القلم / البكتيريا العقدية جيبكو لايف تكنولوجيز 15140-122 RPMI 1640 جيبكو لايف تكنولوجيز 11875-093 تشغيل المخزن المؤقت MACS تشغيل العازلة ، Miltenyi Biotech 130-091-221 نقل الماصة فيشر ساينتيك 13-711-20 قاعدة تريس سيجما ألدريتش [ت1503]