تقنية في المختبر لدراسة العلاجات المضادة للميكروبات على المجاميع البكتيرية

الملخص

المصدر: Gannon ، A. D. ، et al. أدوات للتقييم في الوقت الفعلي لنموذج عدوى الزائفة الزنجارية. J. Vis. Exp. (2021).

يوضح هذا الفيديو تقنية في المختبر لدراسة تأثير العلاج بمضادات الميكروبات على مجاميع Pseudomonas aeruginosa (Pa). تزرع خلايا Pa ذات العلامات الفلورية على شكل مجاميع ، تحاكي نمط النمو أثناء الإصابة. عند تحدي الركام بتركيز شبه مميت من المضاد الحيوي كوليستين ، يتم إجراء التقييم في الوقت الفعلي للتفاعل بين البكتيريا والمضادات الحيوية عبر الفحص المجهري الفلوري.

البروتوكول

< ص الفئة = "jove_title" >1. تحضير وسط التليف الكيسي الاصطناعي (SCFM2)

< p class = "jove_content" >ملاحظة: يتكون إعداد SCFM2 من ثلاث مراحل رئيسية موضحة أدناه (الشكل 1).

1. تعقيم موسين الخنازير
   1. تحضير الميوسين المعقم بتركيز نهائي قدره 5 مجم / مل في SCFM2. على سبيل المثال ، بالنسبة لحجم 5 مل من SCFM2 ، قم بوزن 25 مجم من الميوسين من النوع الثاني في طبق بتري معقم ، وضعه في معقم بالأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة 4 ساعات ، مع تحريكه برفق كل ساعة.
   2. بعد 4 ساعات ، انقل الميوسين المعالج بالأشعة فوق البنفسجية إلى أنابيب معقمة سعة 1.7 مل في ظروف معقمة ، وقم بتخزينها عند -20 درجة مئوية.
   3. لتأكيد التعقيم الكامل ، قم بإذابة عينة من الميوسين في سائل معقم ، مثل الماء أو مرق Luria-Bertani (LB) ، وراقب تحت المجهر.
      ملاحظه: يمكن تخزين الميوسين المعقم عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
2. تحضير قاعدة مخزنة
   1. تحضير محاليل مخزون الملح والأحماض الأمينية عن طريق إضافة الكميات المناسبة من حيث الوزن إلى الماء منزوع الأيونات كما هو موضح في الجدول 1. قم بتعقيم جميع محاليل المخزون باستخدام فلتر 0.22 ميكرومتر ، ولفها بورق الألمنيوم للحماية من تدهور الضوء ، وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
   2. قم بإعداد القاعدة المخزنة عن طريق الجمع بين 190 مل من الماء منزوع الأيونات مع محاليل مخزون الأحماض الأمينية والملح حسب الأحجام المدرجة في الجدول 1. اضبط المحلول على درجة الحموضة 6.8 ، وزده إلى الحجم النهائي البالغ 250 مل. قم بتعقيمه بالفلتر باستخدام فلتر 0.22 ميكرومتر ، وقم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 30 يوما.
   3. في الليلة التي تسبق التجربة ، قم بتقسيم الكمية المطلوبة من القاعدة المخزنة في قارورة مزرعة زجاجية ، وأضف الميوسين (5 مجم / مل كما هو موضح في الخطوة 1.1.1) والحمض النووي للحيوانات المنوية من السلمون المنقى (0.6 مجم / مل). حرك برفق ، ولفه بورق القصدير واتركه عند 4 درجات مئوية طوال الليل للسماح للميوسين والحمض النووي بالذوبان في المحلول.
      ملاحظه: يجب إذابة حمض الحمض النووي للحيوانات المنوية في السلمون على الجليد ، ودوامة ، وإضافتها إلى القاعدة المخزنة والميوسين. يجب تحضير محاليل مخزون التربتوفان والأسباراجين والتيروزين في محاليل هيدروكسيد الصوديوم (انظر الجدول 1 للحصول على تركيزات) بدلا من الماء منزوع الأيونات. احتفظ بالقاعدة المخزنة وجميع محاليل المخزون ملفوفة بورق الألمنيوم للحماية من التعرض للضوء. ستكون معظم الأسهم مستقرة لمدة تصل إلى شهر. لا ينبغي استخدام المخزون الذي يتغير لونها ويجب استبداله قبل الاستخدام.
3. إضافة مخزونات تكميلية
   1. في يوم التجربة ، أضف المخزونات المدرجة في الجدول 2 إلى القاعدة المخزنة التي تحتوي على الميوسين والحمض النووي.
      ملاحظه: قم بإعداد محلول FeSO₄ جديد في يوم التجربة ، ولكن يمكن صنع جميع المخزونات الأخرى في وقت مبكر وتخزينها لمدة 30 يوما عند 4 درجات مئوية. يحتوي 1،2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) على الكلوروفورم. تعامل بحذر ، ولا تستخدمه بالقرب من اللهب المكشوف. بعد إضافة DOPC ، احتضان SCFM2 عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز (250 دورة في الدقيقة) لمدة 20 دقيقة على الأقل (لثقافة 5 مل). تسمح فترة الحضانة هذه للكلوروفورم في DOPC بالتبخر. يجب ألا تكون القارورة محكمة الإغلاق. بدلا من ذلك ، قم بتغطية فتحة القارورة بشكل غير محكم بورق الألمنيوم.

< p class = "jove_title" >2. تقييم في الوقت الفعلي لتحمل مضادات الميكروبات في المجاميع البكتيرية

1. تحضير الثقافات بين عشية وضحاها
   1. في الليلة التي تسبق التجربة ، قم بتلقيح 5 مل من مرق LB بعدة مستعمرات من Pa PAO1-pMRP9-113 من صفيحة أجار LB تحتوي على مضاد حيوي (كاربينيسيلين 300 ميكروغرام / مل). تنمو بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع التحريض عند 250 دورة في الدقيقة .
      ملاحظه: قم بزراعة المزارع بين عشية وضحاها مع إضافة المضادات الحيوية المطلوبة لاختيار البلازميدات المطلوبة (هنا ، بلازميد تعبير البروتين الفلوري الأخضر (GFP) ، pMRP9-1). لاحظ أنه يجب غسل خلايا Pa قبل تلقيح SCFM2. يمكن استبدال LB بوسائط مختبرية غنية أخرى للمزارع الليلية. يجب التعامل مع جميع العزلات البكتيرية باستخدام إرشادات BSL-2 المناسبة في جميع أنحاء هذا البروتوكول.
2. تلقيح SCFM2
   1. في يوم التجربة ، قم بتخفيف الثقافات الليلية من Pa 1:10 (الثقافة: الوسائط السائلة) عن طريق تلقيح 500 ميكرولتر في 5 مل من مرق LB الطازج. تنمو الخلايا حتى مرحلة السجل (60-90 دقيقة) عند 37 درجة مئوية مع التحريك عند 250 دورة في الدقيقة.
   2. مزارع طور سجل الطرد المركزي عند 10,000 × جم لمدة 5 دقائق. اغسل الخلايا عن طريق إزالة المادة الطافية وإعادة تعليقها في 3 مل من محلول ملحي معقم بالفوسفات بالفلتر (PBS ، درجة الحموضة 7.0). كرر مرتين ، وأعد تعليق الحبيبات في حجم نهائي قدره 1 مل من PBS.
   3. قم بقياس امتصاص الخلايا المغسولة باستخدام مقياس الطيف الضوئي عند 600 نانومتر (OD600) ، واحسب حجم الثقافة المطلوبة لبدء OD600 من 0.05 في 5 مل من SCFM2. قم بتلقيح Pa في SCFM2 والدوامة برفق لتوزيع الخلايا في جميع الأنحاء. ماصة 1 مل من SCFM2 الملقحة في كل غرفة من 4 آبار ، قاع زجاجي ، طبق بصري ، واحتضانه لمدة 4 ساعات بشكل ثابت عند 37 درجة مئوية < / > ملاحظه: يعتمد وقت مضاعفة مزارع Pa على الإجهاد وتوافر الأكسجين. في SCFM2 ، في ظل الظروف الموضحة هنا ، يكون وقت مضاعفة Pa ~ 1.4 ساعة.

فئة

3. تصور المجاميع أثناء العلاج بالمضادات الحيوية باستخدام الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر (CLSM)

ملاحظة: يصف هذا القسم استخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر وبرنامج التقاط الصور لتصوير مجاميع Pa في SCFM2. الهدف هو مراقبة وتوصيف الكتلة الحيوية البكتيرية المتبقية (المتحملة) بعد العلاج بالمضادات الحيوية. يمكن تنفيذ الخطوات الموضحة بنجاح على المجاهر متحدة البؤر الأخرى ، على الرغم من أنه يجب الرجوع إلى دليل تشغيل الجهاز للحصول على إرشادات محددة.

1. صورة ثقافات Pa باستخدام غرفة ساخنة أو صفيحة دقيقة ساخنة مثبتة على مرحلة المجهر للحفاظ على درجة حرارة محيطة تبلغ 37 درجة مئوية. ابدأ وحدة الحضانة قبل ساعتين على الأقل من بداية التجربة للسماح لجميع الأجهزة بالوصول إلى درجة الحرارة المطلوبة ، وتقليل المزيد من التمدد والحركة أثناء جمع البيانات.
2. بعد 4 ساعات ، انقل SCFM2 الثقافات التي تحتوي على خلايا Pa إلى مرحلة المجهر الساخن. قم بتعيين 3 من أصل 4 آبار كتكرارات تقنية للعلاج بالمضادات الحيوية ، واعتبر البئر الرابع كضابط بدون علاج ، يحتوي فقط على خلايا Pa في SCFM2 ، بدون مضادات حيوية. حدد المجاميع باستخدام الفحص المجهري للحقل الساطع داخل علامة التبويب تحديد الموقع قبل أي إثارة لمراسلي الفلورسنت. حدد منطقة للتصوير داخل كل بئر ، وقم بتخزين موضعها (إحداثيات xyz) باستخدام وحدة المواضع في برنامج التصوير.
3. استخدم هدف غمر الزيت 63x لتصور مزارع Pa التي تحتوي على بلازميد تعبير GFP pMRP9-1 في SCFM2 بطول موجي للإثارة يبلغ 488 نانومتر وطول موجة انبعاث يبلغ 509 نانومتر. التقط صورا باستخدام خيار z-stack داخل وحدة الاكتساب على فترات 1 ميكرومتر (إجمالي 60 شريحة). استخدم وحدة متوسط الخط لتقليل تألق الخلفية في قناة GFP ضمن الحجم الإجمالي لصور z-stack 60 μm (1,093.5 مم3). التقط صورا تحكم ل SCFM2 غير الملقح باستخدام إعدادات متطابقة لتحديد مضان الخلفية لتحليل الصورة.
   ملاحظه: يتم الحصول على الصور عن طريق إنتاج 512 بكسل × 512 بكسل (0.26 ميكرومتر × 0.26 ميكرومتر بكسل) صور z-stack 8 بت على بعد 60 ميكرومتر من قاعدة الغطاء.
4. استخدم خيار السلسلة الزمنية داخل برنامج التصوير لالتقاط 60 شريحة في كل موضع (بئر) على فترات مدتها 15 دقيقة على مدار 18 ساعة. استخدم استراتيجية التركيز المحددة داخل البرنامج لتخزين مستوى بؤري لكل موضع ، والذي يتم إرجاعه في كل نقطة زمنية طوال التجربة.
5. بعد إجمالي 4.5 ساعة من الحضانة ، قم بتصوير كل موضع باستخدام الإعدادات المذكورة أعلاه لتحديد الكتلة الحيوية الإجمالية داخل كل من الآبار الأربعة قبل إضافة المضاد الحيوي.
6. بعد 6 ساعات من الحضانة الكلية ، أضف المضاد الحيوي بمعدل 2x أقل من الحد الأدنى للتركيز المثبط (MIC) لكل تكرار. الماصة مباشرة وبرفق في منتصف البئر ، أسفل الطور البيني للهواء والسائل مباشرة. الحفاظ على جميع الثقافات في الغرفة متحد البؤر ساخنة.
   ملاحظه: هنا ، تم استخدام كبريتات الكوليستين بتركيز 140 ميكروغرام / مل.
7. ابدأ تصوير العلاج بعد المضادات الحيوية بالنقر فوق خيار بدء التجربة داخل برنامج التصوير.
   ملاحظه: يعتمد تركيز المضادات الحيوية المستخدمة على المضاد الحيوي ، عزل Pa ، وما إذا كان المستخدم يرغب في فحص تأثيرات القتل أو التحمل. تستخدم هذه التجربة جرعة واحدة. يمكن إضافة جرعات إضافية دون تعطيل الثقافات إذا لزم الأمر.

فئة < ص = "jove_title" >4. تلطيخ يوديد البروبيديوم من مجاميع Pa

ملاحظة: يستخدم يوديد البروبيديوم (PI) بشكل شائع ككاشف تلطيخ لتحديد الخلايا البكتيرية غير القابلة للحياة (الميتة) في الثقافة. هنا ، يتم استخدامه لتحديد المجاميع الحساسة للعلاج بالمضادات الحيوية المطبقة في القسم 3. خلال هذا البروتوكول ، يتم استخدام التعبير عن GFP واكتشافها في خلايا Pa كوكيل رئيسي لبقاء الخلية. تسمح هذه الخطوة الأخيرة باستخدام التصوير متحد البؤر مرة أخرى لتحديد الوضع المكاني للمجاميع الحية / الميتة فيما يتعلق ببعضها البعض. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تحديد المجاميع على أنها حية / ميتة لمزيد من فرز الخلايا النهائية في القسم 3.

1. بعد 18 ساعة ، أضف PI إلى كل بئر من الطبق السفلي البصري المكون من أربع غرف والذي يحتوي على مزارع SCFM2. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لحجم PI ووقت الحضانة (على سبيل المثال ، ~ 2 ميكرولتر لكل مل من الثقافة ، ~ 20-30 دقيقة).

< p class = "jove_title" >5. عزل الخلايا الحية عن الركام باستخدام نهج فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS)

ملاحظة: يقدم FACS منصة قوية لفرز وعزل مجموعات الخلايا وفقا لنمط ظاهري مميز بالفلورسنت. هنا ، يتم استخدام FACS لعزل المجاميع الحية (التي تتحمل المضادات الحيوية) من المجاميع غير القابلة للحياة.

1. بعد تلطيخ يوديد البروبيديوم ، قم بإزالة المزارع من الحضانة ، ونقلها إلى أداة FACS في حاوية معزولة للحفاظ على 37 درجة مئوية.
2. قم بتشغيل 1 مل من حصص SCFM2 التي تحتوي على مجاميع Pa بأقل معدل تدفق.
   ملاحظه: سيحتوي كل حصة على ~ 15,000 مجاميع.
3. للكشف عن GFP ، قم بإضاءة الخلايا بليزر 488 نانومتر ، وسجل ارتفاع إشارة الفلورسنت عند 530/30 نانومتر. تصور تلطيخ PI عن طريق الإثارة باستخدام ليزر 561 نانومتر ، وسجل ارتفاع إشارة الفلورسنت عند 610/20 نانومتر. قم بإجراء الفرز باستخدام فوهة 70 u.
   ملاحظه: يمكن تجميع التجميعات التي تم فرزها بطرق متعددة اعتمادا على تطبيق المستخدم. في هذه الحالة ، تم استخدام FACS لفرز مجاميع Pa القابلة للتطبيق لتسلسل الحمض النووي الريبي النهائي.

< p class = "jove_content" >الجدول 1: تحضير مخزون الملح والأحماض الأمينية والحمض النووي والميوسين المطلوب للقاعدة المخزنة لوسط بلغم التليف الكيسي الاصطناعي ، SCFM2.

كيميائي تركيز المخزون (م) التركيز النهائي (مليمتر) تلاحظ NaH₂PO₄ 0.2 1.3 نا₂HPO₄ 0.2 1.25 KNO₃ 1 0.35 دولار ك₂سو₄ 0.25 0.27 NH₄Cl 2.28 أضف مادة صلبة مباشرة إلى القاعدة المخزنة كيه سي إل 14.94 أضف مادة صلبة مباشرة إلى القاعدة المخزنة كلوريد الصوديوم 51.85 دولار أضف مادة صلبة مباشرة إلى القاعدة المخزنة المماسح 10 أضف مادة صلبة مباشرة إلى القاعدة المخزنة سير 0.1 1.45 دولار غلو حمض الهيدروكلوريك 0.1 1.55 برو 0.1 1.66 دولار أمريكي جلاي 0.1 1.2 علاء 0.1 1.78 دولار فال 0.1 1.12 اجتمع 0.1 0.63 ايل 0.1 1.12 لوي 0.1 1.61 دولار أمريكي أورن حمض الهيدروكلوريك 0.1 0.68 ليز حمض الهيدروكلوريك 0.1 2.13 [م] أرج حمض الهيدروكلوريك 0.1 0.31 الحزب 0.1 0.01 محضر في 0.2 M هيدروكسيد الصوديوم أسب 0.1 0.83 دولار محضرة في 0.5 M هيدروكسيد الصوديوم صور 0.1 0.8 محضر في 1.0 M هيدروكسيد الصوديوم Thr 0.1 1.07 دولار سيس حمض الهيدروكلوريك 0.1 0.16 في 0.1 0.53 دولار له حمض الهيدروكلوريك_{H 2}O 0.1 0.52 الحمض النووي للحيوانات المنوية السلمون 0.6 ملغم/مل خنازير الميوسين 5 ملغ/نيلتر

الجدول 2: تحضير مخزونات إضافية مطلوبة لقاعدة مخزنة من وسط بلغم التليف الكيسي الاصطناعي ، SCFM2.

كيميائي تركيز المخزون (م) التركيز النهائي (مليمتر) تلاحظ سكر العنب (D-glu2cose) 1 3 حمض اللاكتيك 1 9.3 اضبط على درجة الحموضة 7.0 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم كلوريد_{الهواء 2} * ح₂س 1 1.75 MgCl₂ * 6 ساعات₂O 1 0.61 FeSO₄ * 7H₂O 1 ملغ/مل 0.0036 اصنعها طازجة يوميا ن-أسيتيل جلوكوزامين 0.25 0.3 1،2-ديولويل-sn-glycero-3-phosphocoline (DOPC) 25 ملغم/مل 100 ميكروغرام / مل احتضان لمدة 20 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية بعد الإضافة

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تحضير وتلقيح وسط SCFM2. (أ) يتم تحضير القاعدة المخزنة باستخدام الأملاح والأحماض الأمينية المدرجة في الجدول 1 والجدول 2. يمكن تخزين القاعدة المخزنة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 30 يوما ، ولكن يجب حمايتها من التعرض للضوء. (ب) يضاف الميوسين والحمض النووي إلى حصة من القاعدة المخزنة ويذوب في محلول طوال الليل عند 4 درجات مئوية. (ج) تضاف الدهون والمخزونات الإضافية إلى المحلول طوال اللي...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الأحماض الأمينية ألانين إيكرز أورجانيكس 56-41-7 ارجينين حمض الهيدروكلوريك النائب 1119-34-2 أسباراجين إيكرز أورجانيكس 56-84-8 محضرة في 0.5 M هيدروكسيد الصوديوم سيستين حمض الهيدروكلوريك ألفا إيسار L06328 حمض الجلوتاميك حمض الهيدروكلوريك إيكرز أورجانيكس 138-15-8 جلايسين إيكرز أورجانيكس 56-40-6 هيستيدين هيدروكلوريك H₂O ألفا إيسار أ 17627 إيزولوسين إيكرز أورجانيكس 73-32-5 لوسين ألفا إيسار أ12311 يسين حمض الهيدروكلوريك ألفا إيسار J62099 الميثيونين إيكرز أورجانيكس 63-68-3 أورنيثين هيدروكلوريك ألفا إيسار أ 12111 فينيل ألانين إيكرز أورجانيكس 63-91-2 برولين ألفا إيسار أ 10199 سيرين ألفا إيسار أ 11179 ثريونين إيكرز أورجانيكس 72-19-5 تريبتوفان إيكرز أورجانيكس 73-22-3 محضر في 0.2 M هيدروكسيد الصوديوم التيروزين ألفا إيسار أ 11141 محضر في 1.0 M هيدروكسيد الصوديوم فالين إيكرز أورجانيكس 72-18-4 مضاد حيوي كاربينسيلين ألفا إيسار J6194903 يوم الأسهم CaCl₂ * 6 ساعات₂O فيشر للكيماويات سي 79-500 سكر العنب (د-جلوكوز) فيشر للكيماويات 50-99-7 1،2-ديولويل-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) فيشر (Avanti Polar Lipids) 4235-95-4 رج العبوة لمدة 15-20 دقيقة عند 37 درجة مئوية لتبخر الكلوروفورم FeSO₄ * 7H₂O إيكرز أورجانيكس هاتف: 7782-63-0 هذا المرق يساوي 1 مجم / مل ، يجب أن يكون طازجا حمض اللاكتيك ألفا إيسار L13242 مخزون الأس الهيدروجيني إلى 7 مع هيدروكسيد الصوديوم MgCl₂ * 6 ساعات₂O إيكرز أورجانيكس 7791-18-6 ن-أسيتيل جلوكوزامين TCI أ 0092 المواد الصلبة المحضرة خنازير الميوسين سيغما M1778-100G تعقيم الأشعة فوق البنفسجية الحمض النووي للحيوانات المنوية السلمون إنفيتروجين 15632-011 وصمه عار يوديد البروبيديوم ألفا إيسار J66764MC أملاح ك₂سو₄ ألفا إيسار أ 13975 كيه سي إل ألفا إيسار J64189 أضف مادة صلبة مباشرة إلى القاعدة المخزنة KNO₃ إيكرز أورجانيكس 7757-79-1 المماسح ألفا إيسار أ 12914 أضف مادة صلبة مباشرة إلى القاعدة المخزنة كلوريد الصوديوم فيشر للكيماويات S271-500 أضف مادة صلبة مباشرة إلى القاعدة المخزنة نا₂HPO₄ RPI S23100-500.0 NaH₂PO₄ RPI الطراز S23120-500.0 NH₄Cl إيكرز أورجانيكس هاتف: 12125-02-9 أضف مادة صلبة مباشرة إلى القاعدة المخزنة المواد الاستهلاكيه أنابيب مخروطية (15 مل) أوليمبوس بلاستيك 28-101 أنابيب مخروطية (50 مل) أوليمبوس بلاستيك 28-106 أنابيب الاستزراع مع غطاء تدفق الهواء أوليمبوس بلاستيك 21-129 طبق 35 مم رباعي الغرف الزجاجي سيلفيس NC0600518 مرق لوريا بيرتاني (LB) جينيسي العلمية 11-118 محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) كواشف فيشر الحيوية BP2944100 أطراف الماصات (ص 200) أوليمبوس بلاستيك 23-150 ريال أطراف الماصات (ص 1000) أوليمبوس بلاستيك 23-165 رل الماصات المصلية (5 مل) أوليمبوس بلاستيك 12-102 الماصات المصلية (25 مل) أوليمبوس بلاستيك 12-106 الماصات المصلية (50 مل) أوليمبوس بلاستيك 12-107 ماء فائق النقاء (خال من RNAse/DNAse)؛ ماء نانوي نقي جينيسي العلمية 18-194 المياه النانوية النقية المستخدمة لتحضير المحاليل في الجدول 1 محاقن (10 مل) دينار بحريني 794412 محاقن (50 مل) دينار بحريني 309653 0.22 مم مرشح حقنة PES أوليمبوس بلاستيك 25-244 PS كوفيت شبه ميكو أوليمبوس بلاستيك 91-408 برمجيات بيوريندر لتحضير الأرقام فاكس ديفا6.1.3 بيكتون ديكنسون ، سان خوسيه ، كاليفورنيا إيماريس Bitplane الإصدار 9.6 زين بلاك معدات فاكس أريالو بيكتون ديكنسون ، سان خوسيه ، كاليفورنيا LSM 880 مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر زييس