مقالة منهجية

القياس الكمي للعدوى البكتيرية في الخلايا المضيفة عن طريق فحص وحدة تكوين المستعمرة

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Gayle، P. et al.، باستخدام مسببات الأمراض البكتيرية للتحقيق في استجابات المضيف على المستوى الخلوي والعضوي.J. Vis. Exp.(2019).

يوضح هذا الفيديو تقنية القياس الكمي في المختبر لتحديد عدوى الليستيريا المستوحدة للبلاعم عن طريق مقايسة وحدة تكوين المستعمرة. تمثل المستعمرات البكتيرية الموجودة على صفيحة الأجار مجموعة البكتيريا داخل الخلايا التي تهرب من آلية الدفاع المضيف وتعيش داخل الضامة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< ص الفئة = "jove_title" >1. تحضير الخلايا للعدوى

  1. نشر خط الخلايا الشبيه بالبلاعم الفأر RAW 264.7 في وسائط زراعة أنسجة DMEM المكملة بمصل ربلة الساق الجنينية بنسبة 10٪ (يشار إليه من الآن فصاعدا باسم DMEM / FCS) باستخدام قارورة 125 مل وحاضنة زراعة الأنسجة التي يتم الاحتفاظ بها عند 37 درجة مئوية / 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
  2. في اليوم السابق للإصابة ، استخدم مكشطة خلوية لإزالة الخلايا من قارورة التمدد وجمعها في أنبوب مخروطي بغطاء لولبي سعة 15 مل. خلايا الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 10 دقائق ، صب المادة الطافية ، تعلق حبيبات الخلية في 1 مل من DMEM / FCS (بدون مضادات حيوية) وتحدد العيار باستخدام مقياس الدم أو عداد الخلايا الآلي.
  3. اضبط العيار على 2 × 106 خلايا / مل وأضف 0.10 مل (2 × 105 خلايا) إلى آبار طبق زراعة الأنسجة المكون من 48 بئرا. تأكد من أن تعليق الخلية يغطي سطح البئر بالكامل.
    1. خلايا صفيحة في آبار إضافية لمصدر لاحق للوسائط المكيفة. أيضا ، ضع 0.10 مل من DMEM / FCS في ثلاثة آبار إضافية لتكون بمثابة "عدم التحكم في الخلية".
  4. احتضان طوال الليل في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية / 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. في اليوم التالي ، لا تقم بإزالتها من الحاضنة حتى يتم تحضير لقاح البكتيريا وتكون جاهزة للاستخدام.
< p class = "jove_title" >2. تحضير الليستريا monocytogenes (Lm) للعدوى

    تلقيح
  1. 2 مل من تسريب الدماغ والقلب (BHI) بمستعمرة واحدة من صفيحة أجار حديثة الخطوط (<2 يوم) من Lm واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع الرج عند 130 دورة / دقيقة.
  2. في اليوم التالي ، أضف 0.10 مل من الثقافة الليلية إلى 2 مل BHI مسخن مسبقا واستمر في الحضانة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز حتى تتراوح الكثافة الضوئية (OD600) بين 0.4 و 0.6.
  3. تحديد العيار البكتيري التقريبي باستخدام صيغة تحويل مشتقة تجريبيا. في مختبرنا ، تبلغ مزرعة Lm المتنامية بشكل كبير في BHI حوالي 1.3 × 109 وحدات تشكيل مستعمرة (CFU) / OD600. قلل من مقدار الوقت الذي تتعرض فيه المزارع البكتيرية لدرجة حرارة الغرفة.
  4. قبل الإصابة مباشرة ، اضبط العيار على 5 × 107 CFU / مل باستخدام DMEM / FCS المسخن مسبقا كمخفف.
< p class = "jove_title" >3. العدوى

  1. العمل بسرعة ودقة ، أضف 20 ميكرولتر (1 × 106 CFU ؛ تعدد العدوى ، وزارة الداخلية = 5) من لقاح Lm المحضر حديثا (الخطوة 2.4 أعلاه) إلى الآبار عن طريق إمالة الطبق قليلا ووضع طرف الماصة بعناية في الوسائط العلوية ؛
    ملاحظة: تجنب لمس جدران البئر بطرف الماصة.
  2. قم بسحب محتويات كل بئر برفق لضمان الخلط الكامل ؛ لا تهز اللوحة أو تميل بشكل كبير لأن هذا سينتشر Lm على جدران البئر. أعد طبق زراعة الخلايا إلى حاضنة 37 درجة مئوية / 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  3. قم بإعداد محلول جنتاميسين 10 ميكروغرام / مل باستخدام وسائط مكيفة من الآبار غير المصابة كمخفف.
  4. بعد 30 دقيقة من الإصابة (mpi) ، أضف بعناية 30 ميكرولتر من محلول الجنتاميسين (التركيز النهائي 2.5 ميكروغرام / مل) وقم بسحب محتويات البئر برفق كما قبل وأعد طبق زراعة الخلايا إلى 37 درجة مئوية / 5٪ حاضنة ثاني أكسيد الكربون2.
  5. عند 60 ميجا في البوصة ، قم بحصاد الآبار المناسبة إما لمقايسة CFU (نقطة زمنية 60 ميلا في البوصة) أو تحليل FCM (كما هو موضح أدناه في القسمين 4 و 5 ، على التوالي).
  6. بالنسبة للآبار المتبقية ، في أوقات مختلفة بعد ذلك ، إما حصاد الخلايا كما كان من قبل أو ، لمقايسة ظهور Lm ، قم بإزالة الوسائط تماما من البئر واستبدالها ب 150 ميكرولتر من الوسائط المكيفة الخالية من الجنتاميسين.
< p class = "jove_title" >4. أخذ العينات والمعالجة وتحليل Lm داخل الخلايا والناشئة بواسطة فحص CFU

  1. للحصاد ، قم بإمالة الطبق قليلا وإزالة الوسائط بأكملها بعناية من البئر. أضف 0.50 مل من الماء المقطر المعقم (dsH2O) إلى البئر. بعد 30 ثانية ، انقل محللة الماء الناتجة (100) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ودوامة بقوة لمدة 10 ثوان.
  2. قم بإعداد 10-1 و 10-2 تخفيفات عن طريق إضافة 4.5 ميكرولتر أو 50 ميكرولتر من محللة الماء إلى 450 ميكرولتر من dsH2O ودوامة لفترة وجيزة لضمان الخلط الشامل.
  3. انشر 50 ميكرولتر من 10عينات 0 و / أو 10-1 و / أو 10-2 على ألواح أجار مرق ليسوجيني (LB).
  4. لفحص Lm الناشئ (الخطوة 3.6 أعلاه) ، قم بإزالة 10 ميكرولتر من وسائط التراكب وقسمها إلى حصتين 5 ميكرولتر: أضف إلى الاقتباس الواحد 5 ميكرولتر من DMEM / FCS وأضف إلى الكمية الثانية 5 ميكرولتر من DMEM / FCS التي تحتوي على 5 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين. يميز عنصر التحكم الأخير بين Lm خارج الخلية (حساس للجنتاميسين) و Lm داخل الخلايا (مقاوم للجنتاميسين) في مقايسة CFU اللاحقة.
  5. بعد 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، أضف 90 ميكرولتر من dsH2O ، دوامة بقوة لمدة 10 ثوان ، وانشر 50 ميكرولتر على ألواح أجار LB.
  6. تعداد مستعمرات Lm على ألواح أجار LB بعد يومين من الحضانة عند 37 درجة مئوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مرق BHI (تسريب قلب الدماغ) EMD ميليبور 110493 DMEM وسائل الإعلام جيبكو 11965-092 FBS - معطل بالحرارة سيجما ألدريتش F4135-500 مل أجار LB تنمو الخلايا التصلب العصبي المتعدد إم بي إي - 4040 TPP زراعة الأنسجة 48 بئر لوحات ميدسي TP92048

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Listeria monocytogenes

مقالات ذات صلة