تحليل قياس التدفق الخلوي لجينات الليستريا المستوحدة داخل الخلايا والناشئة خارج الخلية في المختبر

الملخص

المصدر: Gayle، P. et al. ، استخدام مسببات الأمراض البكتيرية للتحقيق في استجابات المضيف على المستوى الخلوي والجسمي. J. Vis. Exp. (2019)

في هذا الفيديو ، نقوم بتحديد Listeria monocytogenes داخل الخلايا وخارجها ، وهي بكتيريا مسببة للأمراض داخل الخلايا ، بعد إصابتها بالضامة المستنبتة في المختبر باستخدام قياس التدفق الخلوي.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. معالجة وتحليل أخذ العينات من LM داخل الخلايا والناشئة عن طريق قياس التدفق الخلوي (FCM)

1. قم بإعداد خط خلوي يشبه البلاعم RAW 264.7 في وسائط زراعة أنسجة DMEM مكملة بمصل ربلة الساق الجنينية بنسبة 10٪ (يشار إليه من الآن فصاعدا باسم DMEM / FCS) باستخدام قارورة سعة 125 مل وحاضنة لزراعة الأنسجة يتم الاحتفاظ بها عند 37 درجة مئوية / 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}. اضبط الخلايا على 1 × 10⁶ خلايا / مل وأضف 1 مل (1 × 10⁶ خلايا) إلى آبار طبق زراعة الأنسجة المكون من 6 آبار.
2. تحضير الليستيريا monocytogenes ، LM ، لقاح البكتيريا وإصابة الخلايا بحجم اللقاح المقابل لوزارة الداخلية 50 (5 × 10⁷ CFU).
3. في 1.5 ساعة بعد الإصابة (hpi) ، اجمع الوسائط من المجموعة الأولى من الآبار وضعها في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل مع 500 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) وضعها على الجليد حتى تتم معالجة جميع الآبار.
4. لتجميع Lm داخل الخلايا ، أضف 1 مل من ds H₂O إلى البئر وبعد 60 ثانية ، انقل محللة الماء الناتجة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل مع 500 ميكرولتر من 4٪ PFA. دوامة بقوة لمدة 10 ثوان وضعها على الجليد حتى تتم معالجة جميع الآبار.
5. بالنسبة للآبار المتبقية ، قم بإزالة الوسائط واستبدلها ب 1 مل من DMEM / FCS مع 5 ميكروغرام / مل جنتاميسين لقتل Lm خارج الخلية وإعادة الخلايا على الفور إلى الحاضنة.
6. بعد 30 دقيقة (2 hpi) قم بإزالة الوسائط واستبدلها ب DMEM/FCS بدون جنتاميسين.
7. بعد 2 و 4 ساعات (4 و 6 hpi) تأخذ نقاط الزمان الثانية والثالثة عن طريق جمع الوسائط والlysates.
8. أنابيب الطرد المركزي عند 10,000 × جم لمدة 7 دقائق.
9. كل حبيبات في كوكتيل تلطيخ من 50 ميكرولتر من 4٪ PFA و 15 ميكرولتر من الفالويدين. احتضان الأنابيب في الظلام عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
10. بعد الحضانة ، أضف 1 مل من المخزن المؤقت FACS إلى كل أنبوب والماصة لأعلى ولأسفل للخلط.
11. تدور الأنابيب عند 10,000 × جم لمدة 7 دقائق.
12. قم بتعليق كل حبيبات في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS للاستخدام الفوري ، أو 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS و 200 ميكرولتر من 4٪ PFA في حالة التخزين لتحليلها لاحقا.
13. قم بتشغيل العينات على قياس التدفق الخلوي وتحليل البيانات التي تم جمعها.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مرق BHI (تسريب قلب الدماغ) EMD ميليبور 110493 مصفاة الخلية ، 70 ميكرومتر VWR 10199-656 كولاجيناز د روش 11088858001 DMEM وسائل الإعلام جيبكو 11965-092 أنابيب FACS بي دي فالكون 352054 FBS - معطل بالحرارة سيجما ألدريتش F4135-500 مل محلول الملح المتوازن من هانكس سيجما ألدريتش H6648-6X500ML أجار LB تنمو الخلايا التصلب العصبي المتعدد إم بي إي - 4040 LIVE / DEAD قابلة للإصلاح صفراء الخلايا الميتة طقم البقع تقنيات الحياة L349S9 الرودامين فالودين ثيرمو فيشر التوصية 415 SP6800 محلل طيفي سوني TPP زراعة الأنسجة 48 بئر لوحات ميدسي TP92048 TPP زراعة الأنسجة 6 لوحات جيدة ميدسي TP92406