إصابة الذباب بالتعليق البكتيري باستخدام حاقن نانوي

الملخص

المصدر: خليل ، س. وآخرون ، العدوى البكتيرية الجهازية والأنماط الظاهرية للدفاع المناعي في ذبابة الفاكهة السوداء.J. Vis. Exp.(2015)

< p class = "jove_content" >يوضح هذا الفيديو الحقن النانوي للتعليق البكتيري في تجويف جسم الذبابة ، مما يؤدي إلى تكاثر البكتيريا والعدوى. تعمل الاستجابة المناعية للذبابة على إزالة بعض البكتيريا ، بينما يهرب البعض الآخر من التصفية المناعية ويعيش داخل المضيف مسببا العدوى.

البروتوكول

1. جمع الذباب وإعداده

1. ذبابة الفاكهة الخلفية في ظل الظروف التجريبية المرغوبة. احرص على عدم اكتظاظ الذباب أثناء التربية وتأكد من أن كثافة اليرقات متسقة عبر العلاجات لأن الظروف البيئية خلال مرحلة اليرقات يمكن أن تؤثر بشكل عميق على الأنماط الظاهرية للدفاع المناعي خلال مرحلة البلوغ.
2. اجمع الذباب التجريبي بعد 0-3 أيام من الانسقاق من حالة العذراء وانقلها إلى وسط جديد.
3. قم بإسكان الذباب الذي تم جمعه في درجة الحرارة المرغوبة (درجات الحرارة بين 22 درجة مئوية و 28 درجة مئوية مناسبة بشكل عام) حتى يبلغ عمره من 5 إلى 7 أيام بعد الإغلاق.
   ملاحظه: يتيح ذلك وقتا كافيا للذباب لإكمال التحول ويصبح بالغين ناضجين ، ولكن قبل بدء الشيخوخة بوقت طويل.
4. قم بفرز العدد المطلوب من الذباب في قارورة منفصلة قبل الإصابة ، مع الحرص مرة أخرى على تجنب الاكتظاظ. < / > ملاحظه: يصاب الذكور فقط في هذا العرض التوضيحي ولكن من الممكن بنفس القدر إصابة الإناث باستخدام الإجراء الموصوف.

< p class = "jove_title" >2. استزراع وتحضير البكتيريا

1. قم بإعداد لوحة رئيسية للبكتيريا المختارة قبل يومين على الأقل من الإصابة. قم بإزالة البكتيريا من مخزون الجلسرين بنسبة 15٪ المخزن إلى أجل غير مسمى عند -80 درجة مئوية. قم بتخزين اللوحة الرئيسية عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. قم دائما بربط الألواح الرئيسية مباشرة من مخزون الجلسرين المجمد. تجنب المرور التسلسلي للبكتيريا من صفيحة إلى أخرى ، لأن المرور المتكرر في الثقافة يمكن أن يتسبب في تطور البكتيريا للضراوة المخففة.
   ملاحظه: يستخدم هذا المثال Providencia rettgeri و Escherichia coli.
2. استخدم الإجراء التالي لتحضير معلق بكتيري للحقن.
   1. قم بزراعة 2 مل من البكتيريا عن طريق تلقيح وسط معقم بمستعمرة واحدة معزولة من اللوحة الرئيسية. تنمو البكتيريا إلى المرحلة الثابتة (على سبيل المثال نمو O / N عند 37 درجة مئوية).
      ملاحظه: ينمو كل من P. rettgeri و E. coli جيدا في مرق لوريا عند درجات حرارة تتراوح من 20 إلى 37 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف.
   2. بمجرد وصول المزرعة إلى المرحلة الثابتة ، قم بتنظيف خلايا الحبيبات برفق من حوالي 600 ميكرولتر من المزرعة في جهاز طرد مركزي منضدي (3 دقائق عند 5,000 × جم) ، وتخلص من المادة الطافية وأعد تعليق البكتيريا في حوالي 1,000 ميكرولتر من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS ؛ 137 ملي كلوريد الصوديوم ، كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي كلوريد البوتاسيوم ، KCl ، 10 ملي مولار فوسفات الصوديوم ، Na₂PO₄ ، 1.8 ملي فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم ، KH₂PO₄ ، الرقم الهيدروجيني = 7.4).
   قم
   3. بتخفيف الخلايا المعلقة في PBS المعقم لتحقيق كثافة بصرية (OD) مناسبة للبكتيريا المستخدمة ، ويتم قياسها باستخدام مقياس الطيف الضوئي كامتصاص عند 600 نانومتر. استخدم هذا التعليق لإصابة الذباب.
      ملاحظه: يتوافق₆₀₀ = 0.1 أو 1.0 على التوالي مع حوالي 10⁸ و 10⁹ Providencia rettgeri أو الإشريكية القولونية لكل مل. نظرا لأن كل من البكتيريا الحية والميتة تساهم في الكثافة البصرية ، فمن المهم حصاد المزارع في وقت مبكر من المرحلة الثابتة قبل أن تتراكم الجثث البكتيرية وتشوه العلاقة بين الكثافة البصرية وعدد البكتيريا القابلة للحياة التي يتم إدخالها أثناء الإصابة.

< p class = "jove_title" >3. إصابة الذباب

ملاحظة: نظرا لأن مناعة ذبابة الفاكهة تتأثر بإيقاع الساعة البيولوجية ، فمن المهم إجراء العدوى في وقت مماثل من اليوم عبر التكرارات التجريبية.

1. باستخدام حاقن نانوي
   1. تحضير الإبر الزجاجية للعدوى.
      1. قم بإعداد إبرة زجاجية عن طريق سحب الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات باستخدام مجتذب ماصات دقيقة.
      2. باستخدام الملقط ، قم بقطع طرف الإبرة لإنشاء فتحة قطرها حوالي 50 ميكرومتر للسماح بإخراج السائل.
   2. قم بتجميع الحاقن.
      1. ضع الحلقة O المانعة للتسرب ثم الفاصل الأبيض (غمازة كبيرة متجهة للخارج) على المكبس المعدني.
      2. املأ الإبرة الزجاجية بالزيت المعدني باستخدام حقنة بإبرة 30 جرام.
      3. ضع الإبرة الزجاجية المملوءة في الكوليت ثم ضع الحلقة O الأكبر حول قاعدتها ، على بعد حوالي 1 مم من الطرف الحاد للإبرة.
      4. حرك الإبرة على المكبس المعدني وقم بلف الكوليت برفق حتى يتم تثبيته.
      5. أخرج معظم الزيت المعدني من الحاقن ، ولكن تأكد من أنه لا يزال هناك حجم صغير من الزيت في الإبرة ليكون بمثابة حاجز بين الحاقن والمعلق البكتيري. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء داخل الزيت المعدني أو المعلق البكتيري أو بين السائلين.
      6. اضبط الحاقن على الحجم المطلوب للحقن (بين 9 nl و 50 nl).
   3. توليد ضوابط الجرح.
      1. املأ إبرة الحاقن ب PBS معقم عن طريق إدخال طرف الإبرة الشعرية بعناية في أنبوب من الوسائط والضغط على زر "التعبئة" في الحاقن.
         ملاحظه: يمكن أيضا استخدام وسائط نمو البكتيريا المعقمة كعنصر تحكم في الجرح إذا كانت التجربة تتطلب حقن البكتيريا المعلقة في وسط نموها. ومع ذلك ، نظرا لأن وسائط النمو البكتيرية تحتوي على مكونات قد تحفز جهاز المناعة أو لها تأثيرات أخرى على المضيف ، يفضل استخدام الناقل الخامل مثل PBS.
      قم
      2. بتخدير العدد المطلوب من الذباب تحت التدفق الخفيف لثاني أكسيد الكربون (CO₂).
      3. حقن الذباب في البطن الأمامي على السطح البطني الوحشي باستخدام PBS المعقم. < / > ملاحظه: من الممكن أيضا حقن الذباب في مواقع أخرى ، مثل الصفيحة القصية الجنبية للصدر ، ولكن من المهم الحفاظ على اتساق موقع الحقن في كل تجربة.
      4. ضع الذباب المحقون في قوارير طازجة بوسط جديد ، ووضع القوارير على جانبها حتى يتعافى كل الذباب من التخدير لمنع الذباب من الالتصاق بالطعام.
         ملاحظه: يوصى بحقن ذباب التحكم PBS قبل حقن البكتيريا في الذباب التجريبي بحيث يمكن استخدام نفس الإبرة لكلا العلاجين. لن يكون من الممكن دائما استخدام نفس الإبرة لتجربة كاملة. في هذه الحالة ، قد يكون من المرغوب فيه تسجيل الإبرة التي استخدمت بها الذباب وإدراج هوية الإبرة كعامل تجريبي في التحليل الإحصائي.
   4. حقن العامل الممرض البكتيري.
      1. أخرج الوسائط المعقمة المتبقية من الحاقن وأعد ملء نفس الإبرة بالتعليق البكتيري.
      2. كرر الإجراء أعلاه (3.1.3) ، والآن قم بحقن الذباب بالتعليق البكتيري المحضر في الإجراء 2.2.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات حاضنه باورز ساينتفيك ، إنك DROS52SD الرسام ثاني أكسيد الكربون₂ Flypads فلاي ستاف 59-114 ثاني أكسيد الكربون₂ إيرغاز قرص مضغوط FG50 ذبابة الفاكهة مزيج تربية مجهر شركة أوليمبوس ش.ز51 ذبابة الفاكهة قوارير البوليسترين VWR الدولية 89092-720 كرات قطنية كبيرة Nosterile ماركة فيشر 22-456-883 أطباق بتري ذات أغطية شفافة ، سلسلة من التلال المرتفعة ؛ 100 × 15 مم ؛ VWR الدولية هاتف: 25384-302 إل بي أجار ، ميلر ديفكو هاتف: 244520 حلقة التلقيح VWR الدولية 80094-488 ماصات رينين كلاسيك بأحجام مختلفة
0.1 ميكرولتر إلى 2 ميكرولتر ، < / > 2 ميكرولتر إلى 20 ميكرولتر ، < / > 20 ميكرولتر إلى 200 ميكرولتر ،
100 ميكرولتر إلى 1000 رينين PR-2
PR-20
PR-200
PR-1000 أطراف الماصات الدقيقة (أحجام متنوعة) VWR الدولية 30128-376
53503-810
16466-008 قاعدة مرق لوريا ، ميلر ديفكو هاتف: 241420 أنابيب ثقافة يمكن التخلص منها زجاج البورسليكات VWR الدولية هاتف: 47729-576 S-500 شاكر مداري VWR الدولية 14005-830 الطرد المركزي VWR الدولية 37001-300 PBS درجة الحموضة 7.4 10x إنفيتروجين 70011044 مقياس الطيف الضوئي SmartSpec 3000 بيو راد 170-2501 كوفيت نصف ميكروحجم بيو راد هاتف: 223-9955 مجتذب الشعيرات الدموية العمودي مجتذب ماصة إبرة Kopf 3.5 '' الشعيرات الدموية الزجاجية البديلة ل Nanojet II شركة دروموند سينتيفيك 3-000-203-جم / إكس Nanoject II شركة دروموند سينتيفيك 3-000-204 ملقط أدوات العلوم الدقيقة 11255-20 حقنة 10 مل دينار بحريني 309604 زيت معدني أبيض فاتح ماكرون فاين كيماويات 6358-10 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. طقوس الختم شركة USA Scientific Inc. 1615-5500