تقنية وخز الصرف الصحي لإدخال العدوى البكتيرية الجهازية في الذباب

الملخص

المصدر: خليل، س.، وآخرون. العدوى البكتيرية الجهازية والأنماط الظاهرية للدفاع المناعي في ذبابة الفاكهة السوداء. J. Vis. Exp. (2015)

يوضح هذا الفيديو تقنية لإصابة ذبابة الفاكهة عن طريق إدخال بكتيريا مسببة للأمراض مباشرة في تجويف الجسم. تتجاوز هذه الطريقة الحواجز الظهارية وآليات الدفاع السلبي الأخرى ، مما يسمح بتحريض العدوى الجهازية. عند الإصابة ، يتم تقييم الاستجابة المناعية الناتجة عن طريق مراقبة وفيات الذباب وإجراء فحوصات المصب.

البروتوكول

1. جمع الذباب وإعداده

1. الخلف D. melanogaster في ظل الظروف التجريبية المرغوبة. احرص على عدم اكتظاظ الذباب أثناء التربية وتأكد من أن كثافة اليرقات متسقة عبر العلاجات لأن الظروف البيئية خلال مرحلة اليرقات يمكن أن تؤثر بشكل عميق على الأنماط الظاهرية للدفاع المناعي خلال مرحلة البلوغ.
2. اجمع الذباب التجريبي بعد 0-3 أيام من الانسقاق من حالة العذراء وانقلها إلى وسط جديد.
3. قم بإسكان الذباب الذي تم جمعه في درجة الحرارة المرغوبة (درجات الحرارة بين 22 درجة مئوية و 28 درجة مئوية مناسبة بشكل عام) حتى يبلغ عمره من 5 إلى 7 أيام بعد الإغلاق.
   ملاحظه: يتيح ذلك وقتا كافيا للذباب لإكمال التحول ويصبح بالغين ناضجين ، ولكن قبل بدء الشيخوخة بوقت طويل.
4. قم بفرز العدد المطلوب من الذباب في قارورة منفصلة قبل الإصابة ، مع الحرص مرة أخرى على تجنب الاكتظاظ.
   ملاحظه: يصاب الذكور فقط في هذا العرض التوضيحي ولكن من الممكن بنفس القدر إصابة الإناث باستخدام الإجراء الموصوف.

< p class = "jove_title" >2. استزراع وتحضير البكتيريا

1. قم بإعداد لوحة رئيسية للبكتيريا المختارة قبل يومين على الأقل من الإصابة. قم بإزالة البكتيريا من مخزون الجلسرين بنسبة 15٪ المخزن إلى أجل غير مسمى عند -80 درجة مئوية. قم بتخزين اللوحة الرئيسية عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. قم دائما بربط الألواح الرئيسية مباشرة من مخزون الجلسرين المجمد. تجنب المرور التسلسلي للبكتيريا من صفيحة إلى أخرى ، لأن المرور المتكرر في الثقافة يمكن أن يتسبب في تطور البكتيريا للضراوة المخففة.
   ملاحظه: يستخدم هذا المثال Providencia rettgeri و Escherichia coli.
2. استخدم الإجراء التالي لتحضير معلق بكتيري للحقن.
   1. قم بزراعة 2 مل من البكتيريا عن طريق تلقيح وسط معقم بمستعمرة واحدة معزولة من اللوحة الرئيسية. تنمو البكتيريا إلى المرحلة الثابتة (على سبيل المثال نمو O / N عند 37 درجة مئوية).
      ملاحظه: ينمو كل من P. rettgeri و E. coli جيدا في مرق لوريا عند درجات حرارة تتراوح من 20 إلى 37 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف.
   2. بمجرد وصول المزرعة إلى المرحلة الثابتة ، قم بخلط خلايا الحبيبات برفق من حوالي 600 ميكرولتر من المزرعة في جهاز طرد مركزي منضدي (3 دقائق عند 5,000 × جم) ، وتخلص من المادة الطافية وأعد تعليق البكتيريا في حوالي 1,000 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات المعقم (PBS ؛ 137 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي كلوريد الصوديوم ، 10 ملي Na₂PO₄ ، 1.8 ملي مولار KH₂PO₄ ، الرقم الهيدروجيني = 7.4).
   قم
   3. بتخفيف الخلايا المعلقة في PBS المعقم لتحقيق كثافة بصرية (OD) مناسبة للبكتيريا المستخدمة ، ويتم قياسها باستخدام مقياس الطيف الضوئي كامتصاص عند 600 نانومتر. استخدم هذا التعليق لإصابة الذباب.
      ملاحظه: A600 = 0.1 أو 1.0 يتوافق على التوالي مع ما يقرب من 10⁸ و 10⁹ Providencia rettgeri أو الإشريكية القولونية لكل مل. نظرا لأن كل من البكتيريا الحية والميتة تساهم في الكثافة البصرية ، فمن المهم حصاد المزارع في وقت مبكر من المرحلة الثابتة قبل أن تتراكم الجثث البكتيرية وتشوه العلاقة بين الكثافة البصرية وعدد البكتيريا القابلة للحياة التي يتم إدخالها أثناء الإصابة.

< p class = "jove_title" >3. إصابة الذباب

ملاحظة: نظرا لأن مناعة ذبابة الفاكهة تتأثر بإيقاع الساعة البيولوجية ، فمن المهم إجراء العدوى في وقت مماثل من اليوم عبر التكرارات التجريبية.

1. مع وخز الصرف الصحي
   1. تحضير الإبرة للوخز.
      1. قم بإذابة نهاية طرف ماصة دقيقة سعة 200 ميكرولتر وأدخل دبوس دقيق للحشرات مقاس 0.15 مم في البلاستيك المصهور. اسمح للبلاستيك بالتصلب بحيث يتم تثبيت الدبوس في مكانه مع امتداد حوالي 0.5 سم من الدبوس من البلاستيك.
   2. توليد ضوابط الجرح.
      1. قم بتخدير العدد المطلوب من الذباب تحت تدفق خفيف من ثاني أكسيد الكربون₂.
      2. وخز الذباب في الصفيحة القصية الجنبية للصدر بالإبرة ، وتجنب مواقع التعلق بالأجنحة والساقين. إذا لزم الأمر ، قم بإزالة الذباب برفق من دبوس minutien باستخدام ملقط ناعم.
         ملاحظه: من الممكن أيضا وخز الذباب في مواقع أخرى ، مثل البطن الأمامي على السطح البطني الجانبي ، ولكن من المهم الحفاظ على اتساق موقع الحقن في كل تجربة. يميل وخز بشرة البطن إلى أن يكون أكثر صعوبة من وخز الصدر وبالتالي فهو أقل شيوعا.
      3. ضع الذباب المثقوب في قارورة جديدة مع وسيط ذبابة جديد ، ووضع القارورة على جانبها حتى يتعافى كل الذباب من التخدير لمنع الذباب من الالتصاق بالطعام.
   3. إدخال العدوى البكتيرية.
      1. قم بتخدير العدد المطلوب من الذباب تحت تدفق خفيف من ثاني أكسيد الكربون₂.
      2. وخز كل ذبابة في نفس الموقع الذي تتحكم فيه الوسائط ، واغمس طرف الدبوس في التعليق البكتيري المحضر في الإجراء 2.2 قبل وخز كل ذبابة.
      3. ضع الذباب المثقوب في قارورة جديدة مع وسيط ذبابة جديد ، ووضع القارورة على جانبها حتى يتعافى كل الذباب من التخدير لمنع الذباب من الالتصاق بالطعام.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات حاضنه باورز ساينتفيك ، إنك DROS52SD الرسام ثاني أكسيد الكربون₂ Flypads فلاي ستاف 59-114 ثاني أكسيد الكربون₂ إيرغاز قرص مضغوط FG50 ذبابة الفاكهة مزيج تربية 6 أوقية زجاجات مربعة القاع ، بولي بروبيلين جينيسي العلمية 32-130 كرات قطنية كبيرة جدا Nosterile ماركة فيشر 22-456-882 مجهر شركة أوليمبوس ش.ز51 ذبابة الفاكهة قوارير البوليسترين VWR الدولية 89092-720 كرات قطنية كبيرة Nosterile ماركة فيشر 22-456-883 قارورة 2 لتر VWR الدولية 89000-370 أطباق بتري ذات أغطية شفافة ، سلسلة من التلال المرتفعة ؛ 100 × 15 مم ؛ VWR الدولية هاتف: 25384-302 إل بي أجار ، ميلر ديفكو هاتف: 244520 حلقة التلقيح VWR الدولية 80094-488 ماصات رينين كلاسيك بأحجام مختلفة
0.1 ميكرولتر إلى 2 ميكرولتر ، < / > 2 ميكرولتر إلى 20 ميكرولتر ، < / > 20 ميكرولتر إلى 200 ميكرولتر ،
100 ميكرولتر إلى 1000 رينين PR-2
PR-20
PR-200
PR-1000 أطراف الماصات الدقيقة (أحجام متنوعة) VWR الدولية 30128-376
53503-810
16466-008 قاعدة مرق لوريا ، ميلر ديفكو هاتف: 241420 أنابيب ثقافة يمكن التخلص منها زجاج البورسليكات VWR الدولية هاتف: 47729-576 S-500 شاكر مداري VWR الدولية 14005-830 الطرد المركزي VWR الدولية 37001-300 PBS درجة الحموضة 7.4 10x إنفيتروجين 70011044 مقياس الطيف الضوئي SmartSpec 3000 بيو راد 170-2501 كوفيت نصف ميكروحجم بيو راد هاتف: 223-9955 ملقط أدوات العلوم الدقيقة 11255-20 زيت معدني أبيض فاتح ماكرون فاين كيماويات 6358-10 دبابيس Minutein أدوات العلوم الدقيقة 26002-10 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. طقوس الختم شركة USA Scientific Inc. 1615-5500