قياس الحمل البكتيري للإشريكية القولونية في ذبابة الفاكهة السوداء بعد عدوى الإشريكية القولونية

الملخص

المصدر: Khalil، S.، et al. العدوى البكتيرية الجهازية والأنماط الظاهرية للدفاع المناعي في ذبابة الفاكهة السوداء. J. Vis. Exp. (2015)

في هذا الفيديو ، نوضح تقنية لقياس الإشريكية القولونية الحمل البكتيري بعد حقن الإشريكية القولونية في صدر ذبابة الفاكهة السوداء.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. فحص الحمل البكتيري بعد العدوى

1. قياس الحمل البكتيري.
   1. في وقت محدد بعد الحقن ، ضع كل ذبابة في أنبوب طرد مركزي دقيق على الجليد.
   2. أضف 250 ميكرولتر من PBS إلى كل أنبوب وقم بتجانس الذباب إما باستخدام مدقة أو مضرب خرزة.
   3. قم بلوحة المتجانسة على لوحة أجار LB ، إما باستخدام طبق حلزوني أو تخفيف تسلسلي.
      1. إلى اللوحة باستخدام التخفيف التسلسلي ، انقل كل ذبابة متجانسة إلى الصف الأول من صفيحة 96 بئرا.
      2. املأ كل بئر من الصفوف المتبقية ب 90 ميكرولتر من PBS.
      3. باستخدام ماصة متعددة القنوات، خذ 10 ميكرولتر من الصف الأول الذي يحتوي على متجانس الذباب ووزعه في الصف الثاني.
      4. الماصة لأعلى ولأسفل 10 مرات على الأقل لخلطها جيدا ، ثم خذ 10 ميكرولتر ونقلها إلى الصف الثالث. كرر هذا الإجراء باستخدام الصفوف المتبقية.
      5. بدءا من الصف السفلي (معظم تعليق البكتيريا المخفف)، استخدم الماصة متعددة القنوات لأخذ 10 ميكرولتر من كل بئر وإيداعها على لوح LB، مع الحرص على توزيع العينات كنقاط منفصلة لا تلامس بعضها البعض. كرر حتى يتم أخذ عينات من جميع الآبار من كل صف ، وقم بتوزيعها بترتيب تنازلي للتخفيف على لوحة LB.
      6. اترك الطبق في RT حتى تنقع البقع تماما في لوحة LB.
         ملاحظه: يوصى بتجفيف لوحة LB لبضعة أيام في RT قبل الاستخدام لضمان امتصاص السائل بسهولة ، مما يقلل من فرص التلامس العرضي بين بقع العينة.
   4. احتضان الألواح O / N ، مع الحرص على عدم زيادة نمو الصفائح حتى تظل المستعمرات صغيرة ومنفصلة.
      ملاحظه: اعتمادا على وسط نمو البكتيريا ودرجة حرارة الحضانة المستخدمة ، قد تظهر المستعمرات المشتقة من ميكروبات الأمعاء الداخلية للذبابة في النهاية على اللوحة. ومع ذلك ، فإن معظم البكتيريا المستخدمة في العدوى المسببة للأمراض تنمو بشكل أسرع بكثير من ميكروبات الأمعاء في LB أجار عند 37 درجة مئوية.
   5. قم بإزالة الصفائح من الحاضنة عندما تنمو البكتيريا التجريبية مستعمرات مرئية (عادة من 8 إلى 12 ساعة) ، ولكن قبل ظهور مستعمرات ذبابة الفاكهة المجهرية المعوية (حوالي 36 ساعة). بالنسبة للبكتيريا التجريبية بطيئة النمو ، استخدم مضادا حيويا انتقائيا في LB agar لإزالة أي مستعمرات من ميكروبات الأمعاء.
   6. احسب عدد المستعمرات لكل متجانس.
      1. بالنسبة للصفائح الحلزونية ، احسب المستعمرات التي تنمو باستخدام عداد مستعمرات آلي يمكنه تقدير الحمل البكتيري لكل مل من التجانس بناء على عدد وموضع المستعمرات على اللوحة.
         ملاحظة: تكون الأعداد الحلزونية أكثر دقة عندما يكون تركيز البكتيريا في حدود 5 × 10² إلى 5 × 10⁴ بكتيريا لكل مل.
      2. بالنسبة للألواح الموضعية ، قم بحساب المستعمرات يدويا لكل ذبابة من أي تخفيف يحتوي على 30-300 مستعمرة واحسب عدد البكتيريا لكل مل من المتجانس الأصلي.
2. تحليل البيانات.
   1. إذا كان الحمل البكتيري غير طبيعي ، فقم إما بتحويل البيانات لتقريب التوزيع الطبيعي بشكل أفضل أو تحليل البيانات باستخدام التحليل الإحصائي غير المعلمي (على سبيل المثال ، اختبار Mann-Whitney U). استخدم تحليل Box-Cox للعثور على التحويل الأمثل ؛ غالبا ما تكون تحويلات السجل الطبيعي أو السجل الأساسي -10 فعالة.
   2. إذا تم توزيع البيانات بشكل طبيعي بشكل كاف ولم يكن هناك سوى علاجين متناقضين ، فقم بإجراء اختبار t لتحديد ما إذا كان العلاجان يؤديان إلى متوسط أحمال بكتيرية مختلفة. إذا كانت هناك متغيرات تجريبية متعددة أو عوامل تنبؤية أخرى محتملة ، فاستخدم تحليل التباين (ANOVA) لتحديد العوامل التي تعتبر تنبؤات مهمة بالحمل البكتيري.

المواد