فحص لتحديد الجرعة المعدية للفيروس من ذبابة الفاكهة C في خلايا الحشرات المستنبتة

الملخص

المصدر: Yang، S. et al. ، إنشاء العدوى الفيروسية وتحليل تفاعل الفيروس المضيف في ذبابة الفاكهة السوداء. J. Vis. Exp. (2019)

في هذا الفيديو ، نوضح مقايسة تأثير الاعتلال الخلوي لتحديد الجرعة الفيروسية المعدية لزراعة الأنسجة لفيروس ذبابة الفاكهة C على خلايا ذبابة الفاكهة S2 *. تستخدم مجموعة من التركيزات الفيروسية لإصابة الخلايا المستنبتة. يتم تحديد نسبة الخلايا التي تظهر تغيرات هيكلية ، وتستخدم هذه البيانات لحساب الجرعة المعدية لزراعة الأنسجة.

البروتوكول

1. ذبابة الفاكهة C قياس حمل الفيروس عن طريق مقايسة CPE

1. اختر 5 أنابيب عشوائية تحتوي على فيروسات لتحديد متوسط الجرعة المعدية لزراعة أنسجة الفيروس (TCID₅₀) عن طريق مقايسة تأثير الاعتلال الخلوي (CPE) (وحدة واحدة من TCID₅₀ = 0.7 وحدة تشكيل البلاك [PFU]).
   ملاحظه: يشير CPE إلى التغيرات الهيكلية في الخلايا المضيفة الناجمة عن الغزو الفيروسي. يتسبب الفيروس المصاب في تحلل الخلية المضيفة أو عندما تموت الخلية دون تحلل بسبب عدم القدرة على التكاثر.
2. في اليوم 1 ، اجمع خلايا S2 * المحضرة عن طريق سحب العينات. عد رقم الخلية. خلايا الطرد المركزي لمدة 300 × جم لمدة 4 دقائق وتخلص من المادة الطافية. خفف الخلايا إلى كثافة 1 × 10⁶ خلايا / مل مع وسيط كامل لخلايا S2 *.
3. بذرة 1 × 10⁵ S2 * خلايا (100 ميكرولتر) لكل بئر إلى صفيحة 96 بئر مسطحة القاع (~ 30٪ التقاء).
4. قم بإجراء تخفيفات تسلسلية 10 أضعاف لمخزون DCV مع وسيط كامل لخلايا S2 *. أضف 50 ميكرولتر من التخفيفات في البئر. أضف 50 ميكرولتر من وسط الاستزراع بدون فيروس إلى البئر المصنف على أنه بئر تحكم سلبي.
   ملاحظه: لكل معدل تخفيف ، تم استخدام 8 آبار. نظرا لأن عائد DCV النموذجي يبلغ حوالي 10^{8-10 9} PFU / مل ، يجب أن يغطي التخفيف على الأقل ~ ^10-5-10−10.
5. في اليوم 4 ، راقب CPE باستخدام مجهر المجال الساطع بهدف 20X أو 40X. صنف البئر الذي تبدو فيه الخلايا ضبابية والوسط مليء بالشظايا على أنه "بئر إيجابي" ، وبئر يكون فيها مورفولوجيا الخلية طبيعيا على أنه "بئر سلبي".
6. ضع علامة على الآبار الإيجابية أو السالبة CPE ب + أو - ، على التوالي. احسب الفيروس TCID₅₀ بطريقة Reed and Muench.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وسم 352070 طبق زراعة الخلايا 10 سم سيغما CLS430167 زراعة الخلايا حاضنة الخلية سانيو مير-553 الطرد المركزي إيبندورف 5810 ص الطرد المركزي إيبندورف 5424 ص ذبابة الفاكهة حاضنة بيرسيفال ط 41NL تربية ذبابة الفاكهة FBS إنفيتروجين هاتف: 12657-029 زراعة الخلايا وسط حشرة شنايدر سيغما S9895 زراعة الخلايا البرمجيات الإحصائية GraphPad المنشور 7 قاع مسطح 96 لوحة بئر سيغما CLS3922 زراعة الخلايا حاضنة الخلية سانيو مير-553 مجهر أوليمبوس CKX41