الكشف عن تنشيط الالتهابات عن طريق المجهر الفلوري

الملخص

المصدر: den Hartigh، A. B. et al.، الكشف عن تنشيط الالتهاب وموت الخلايا المتفتحة في الضامة المشتقة من نخاع عظم الفئران. J. Vis. Exp.(2018)

يوضح هذا الفيديو طريقة للكشف عن تنشيط التهاب NLRP3 في الضامة باستخدام مجسات مراسل الفلورسنت. تتم معالجة الخلايا بأيونوفورات البوتاسيوم والجلايسين للحث على تجميع الالتهابات وتنشيط الكاسباز -1. تصور مجسات مراسل الفلورسنت الكاسباز 1 المنشط ، ويتم تلطيخ الخلايا بصبغة فلورية لتصور النوى.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< ص class = "jove_title" >1. حصاد نخاع العظام

1. قم بإزالة عظم الفخذ والساق بشكل معقم من الفأر وتنظيف العظام باستخدام أدوات معقمة. ضع العظام النظيفة في Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + 5 مللي N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid (HEPES) + 0.2 ملغ/مل L-glutamine + 0.05 مللي 2-ميركابتو إيثانول + 50 ملغ/مل كبريتات جنتاميسين + 10,000 واحد/مل بنسلين/ستربتومايسين + 10٪ مصل بقري جنيني (FBS، DMEM-10 كامل) واحتضان الأنبوب على الثلج لمدة 15 دقيقة.
2. قم بإزالة المفاصل الكروية القريبة والبعيدة باستخدام المقص. أدخل إبرة 25 جم متصلة بحقنة سعة 10 مل مملوءة بالوسط في تجويف العظام. اغسل نخاع العظم باستخدام DMEM-10 كامل. أعد تعليق أي كتل عن طريق سحب الوسط لأعلى ولأسفل برفق.
3. قم بالطرد المركزي للخلايا لمدة 10 دقائق عند 300 × جم واحسب عدد الخلايا باستخدام مقياس الدم. في هذه المرحلة ، قم إما بتجميد الخلايا باستخدام 90٪ FBS + 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) أو قم بوضع الخلايا في طبق بتري مقاس 15 سم للتمييز بين البلاعم باستخدام الوسط المكيف L929 (الخطوة 2.1).

< p class = "jove_title" >2. تمايز البلاعم المشتقة من نخاع العظام

1. باستخدام وسط التمايز الدافئ مسبقا (21 مل من DMEM-10 الكامل و 9 مل من الوسط المكيف للخلايا L929 كما هو موضح من قبل Swanson et al.) ، ضع خلايا نخاع العظم في طبق بتري غير معالج بزراعة الأنسجة مقاس 15 سم (1.2-1.5 × 10⁷ خلايا). احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون ، أو ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 7 أيام. أضف 30 مل إضافيا من وسيط التمايز إلى الطبق في اليوم 3 أو 4. < / > ملاحظه: من المهم عدم استخدام الألواح المعالجة بزراعة الأنسجة ، حيث سيكون من الصعب فصل البلاعم وحصادها.
2. لجمع البلاعم ، اغسل اللوحة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) وأضف 20 مل من PBS البارد + 1 ملي مولار من حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA). احتضن الطبق عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. احصد الخلايا عن طريق سحب PBS + EDTA فوق الخلايا وغسل اللوحة ب 10 مل من PBS. امزج كلتا الغسيلتين في أنبوبين مخروطيين سعة 15 مل.
3. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم لمدة 10 دقائق وأعد تعليق الخلايا في 10 مل من DMEM الخالي من الفينول الأحمر + 5 ملي هيبس + 0.2 مجم / مل ل-جلوتامين + 0.05 ملي مولار 2-ميركابتو إيثانول + 5٪ FBS (DMEM-5) وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم أو عداد كولتر. احتفظ بالخلايا على الجليد أثناء العد.
4. قم بزرع البلاعم في ألواح مغلفة بزراعة الأنسجة عند 2 × 10⁵ خلايا / مل. بالنسبة لتجارب الفحص المجهري ، قم بزرع 1 مل من الخلايا على أغطية في 24 لوحة بئر. لفحوصات إطلاق نازعة هيدروجين اللاكتات (LDH) ، قم ببذور 100 ميكرولتر من الخلايا في صفيحة مكونة من 96 بئرا. بالنسبة لمقايسة LDH ، قم ببذور 9 آبار (3 آبار غير معالجة ، و 3 آبار مع ضوابط تحلل بنسبة 100٪ ، و 3 آبار للتحفيز التجريبي).
5. قم بالطرد المركزي للوحة 96 بئرا لمدة 5 دقائق عند 300 × جم للتأكد من توزيع الخلايا بالتساوي عبر البئر.
6. احتضن اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية + 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ قبل بدء عملية التحضير.

< p class = "jove_title" >3. فتيلة

1. استبدل الوسط بوسط جديد (DMEM-5) يحتوي على 100 نانوغرام / مل عديد السكاريد الدهني أو LPS (500 ميكرولتر للصفيحة المكونة من 24 بئرا أو 50 ميكرولتر للصفيحة المكونة من 96 بئرا).
   ملاحظه: هناك مجموعة متنوعة من الاختلافات الهيكلية في LPS ، والتي تؤثر على القدرة على تحفيز التحضير بوساطة TLR4. LPS من Salmonella minnesota R595 (Re) متاح من بائعين متعددين ويوصى به.
2. احتضان اللوحة لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.

فئة

4. تنشيط NLRP3 Inflammasome مع النيجيريسين ووضع العلامات باستخدام FAM-YVAD-FMK

1. قم بإزالة الوسط واستبدله ب 290 ميكرولتر من DMEM-5 يحتوي على 5 ميكرومتر من النيجيريسين و 5 ملي مولار جلايسين. يضاف الجلايسين لتقليل كمية تحلل الخلايا التي تحدث أثناء تنشيط كاسباز -1. احتضان لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}. استخدم كلا من البلاعم الناقصة من النوع البري وكاسباز -1 للتأكد من أن الملصقات المرصودة خاصة ب caspase-1.
2. خلال آخر 45 دقيقة ، أضف 10 ميكرولتر من 30x FAM-YVAD-FMK ، المحضرة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
3. بعد 60 دقيقة ، قم بإزالة الوسط واغسل الخلايا ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها 1 مل من PBS البارد.
4. أضف 250 ميكرولتر من 2٪ بارافورمالدهيد إلى كل بئر واحتضنه على الثلج المغطى بورق الألمنيوم لمدة 30 دقيقة.
5. خلال آخر 5 دقائق ، أضف 4 ميكرولتر من 0.2 ملي مولار بقعة الحمض النووي الفلوري الأحمر الفاتح لتسمية النوى. يمكن أيضا استخدام 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ، أو أصباغ أخرى لتسمية الحمض النووي.
6. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1 مل من PBS البارد وقم بتركيب الغطاء على شرائح المجهر باستخدام وسيط تركيب مضاد للبهتان سعة 7 ميكرولتر. دع وسط التثبيت يتماسك طوال الليل قبل إغلاق الغطاء بشريحة المجهر باستخدام طلاء الأظافر.
7. تصوير البلاعم عن طريق المجهر متحد البؤر. Ex / Em ل FAM-YVAD-FMK هو 492/520 نانومتر و 642/661 لصبغة الحمض النووي الفلوري الأحمر البعيد. تأكد من إعداد المجهر بحيث لا تظهر الخلايا غير المعالجة أي تلطيخ في الخلفية في القناة 488. خلاف ذلك ، سيتم الكشف عن تلطيخ FAM-YVAD-FMK في الخلفية وليس caspase-1 النشط الفعلي.

< p class = "jove_title" >5. تصوير البلاعم المصنفة بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر

ملاحظة: يمكن رؤية الخلايا الملطخة بعد السماح للغطاء بالشفاء طوال الليل وإغلاقها على شريحة المجهر باستخدام طلاء الأظافر. هنا ، يتم وصف التصوير باستخدام المجهر متحد البؤر. يمكن أيضا عرض الخلايا عن طريق الفحص المجهري الفلوري القياسي.

1. ضع الشريحة مع خلايا التحكم غير المعالجة على مرحلة المجهر وركز المجهر على الخلايا.
2. باستخدام إعدادات جدول البحث المجهري (LUT) ، اضبط الإزاحة بحيث لا يكون هناك تلطيخ إيجابي FAM-YVAD-FMK في الخلايا غير المعالجة. يمكن أيضا إجراء هذه العملية باستخدام الضامة الناقصة في caspase-1.
   ملاحظه: يجب ضبط الإزاحة لكل قناة مستعملة في التجربة ، ولكن تحديد الإزاحة الصحيحة هو الأكثر أهمية لقناة FAM-YVAD-FMK وقنوات الأجسام المضادة الفلورية. إزاحة قناة الحمض النووي أقل أهمية. بمجرد تعيين الإزاحة، لا تضبط هذا الإعداد لبقية التجربة.
3. قم بتبديل الشريحة إلى العينة المعالجة بالنيجيرسين. ابحث عن حقل يحتوي على كل من الخلايا الموجبة والسالبة لتلوين FAM-YVAD-FMK. اضبط مستوى التصوير لقناة FAM-YVAD-FMK على المستوى الذي يحتوي على أعلى شدة من التلوين الإيجابي. عادة ما يكون هذا هو المستوى الذي يتم فيه تصوير مركز التركيز الالتهابي.
4. اضبط الكسب بحيث تكون البؤر مرئية في الخلايا التي تحتوي على نوى مكثفة. بعد ضبط كل من الكسب والإزاحة، اترك هذه الإعدادات لبقية جلسة التصوير.
   ملاحظه: إحدى الطرق السهلة لتحديد ما إذا كانت الخلية متحركة هي النظر إلى التشكل النووي. تحتوي الخلايا ذات الكاسباز -1 النشط على نوى مستديرة ومكثفة ، بينما تظهر النوى في الخلايا التي لا تحتوي على تنشيط كاسباز -1 والتشكل النووي مشابه لتلك الموجودة في الخلايا غير المعالجة.
5. اجمع صورا ل 5 حقول تم اختيارها عشوائيا بتكبير إجمالي 100X. سينتج عن هذا عادة حوالي 40 خلية لكل صورة. كرر هذه العملية لكل عينة.
6. احسب عدد الخلايا في كل صورة باستخدام برنامج تحليل الصور. ثم احسب عدد الخلايا التي تحتوي على تلطيخ إيجابي FAM-YVAD-FMK. تمثيل مستوى تنشيط caspase-1 كنسبة مئوية للخلايا الإيجابية FAM-YVAD-FMK.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات إي إم ATCC 30-2003 لزراعة خلايا L929 استنساخ NCRC 929 (L929) ATCC CCL-1 طقم التثبيت / النفاذية BD Biosciences 554714 يتضمن محلول التثبيت والنفاذية ، ومحلول الغسيل. تركيبات خاصة. يحتوي على 4.2٪ فورمالديهايد جلايسين بيوراد 161-0718 فام - YVAD - FMK تقنيات الكيمياء المناعية 98 Dulbecco's PBS ، خال من الكالسيوم ، بدون مغنيسيوم إنفيتروجين 14190144 مصل الأبقار الجنينية، مؤهل، أمريكي المنشأ إنفيتروجين 26140079 يتم تعطيل الحرارة عند 55 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة الجنتاميسين إنفيتروجين 15750060 إطالة الذهب تصاعد المتوسطة إنفيتروجين ص 36934 تركيبة خاصة. علاج وسط تصاعد. تصلب إلى مؤشر حراري عند 1.46 HEPES (نقي للغاية) إنفيتروجين 11344041 ل-جلوتامين إنفيتروجين 21051024 البنسلين - ستربتومايسين إنفيتروجين 15140122 الماوس C57BL / 6J مختبر جاكسون 664 ب Caspase-1/11-/- ماوس مختبر جاكسون 16621 مجهر متحد البؤر Leica SP8X لايكا LPS فائق النقاء من السالمونيلا المينيسوتا R595 (إعادة) قائمة البيولوجية 434 بيتا ميركابتو إيثانول ميليبور سيجما M6250-10 مل DMSO ميليبور سيجما D2650-5X10ML EDTA ميليبور سيجما E5391