$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
فئة
1. تمايز البلاعم المشتقة من نخاع العظام
- باستخدام وسط التمايز الدافئ مسبقا (21 مل من DMEM-10 الكامل و 9 مل من الوسط المكيف للخلايا L929 كما هو موضح من قبل Swanson et al.) ، ضع خلايا نخاع العظم في طبق بتري غير معالج بزراعة الأنسجة مقاس 15 سم (1.2-1.5 × 107 خلايا). احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 7 أيام. أضف 30 مل إضافيا من وسط التمايز إلى الطبق في اليوم 3 أو 4.
ملاحظه: من المهم عدم استخدام الألواح المعالجة بزراعة الأنسجة ، حيث سيكون من الصعب فصل البلاعم وحصادها.
- لجمع البلاعم ، اغسل اللوحة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) وأضف 20 مل من PBS البارد + 1 ملي مولار من حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA). احتضن الطبق عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. احصد الخلايا عن طريق سحب PBS + EDTA فوق الخلايا وغسل اللوحة ب 10 مل من PBS. امزج كلتا الغسيلتين في أنبوبين مخروطيين سعة 15 مل.
- قم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم لمدة 10 دقائق وأعد تعليق الخلايا في 10 مل من DMEM الخالي من الفينول الأحمر + 5 ملي هيبس + 0.2 مجم / مل ل-جلوتامين + 0.05 ملي مولار 2-ميركابتو إيثانول + 5٪ FBS (DMEM-5) وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم أو عداد كولتر. احتفظ بالخلايا على الجليد أثناء العد.
- قم بزرع البلاعم في ألواح مغلفة بزراعة الأنسجة عند 2 × 105 خلايا / مل. بالنسبة لتجارب الفحص المجهري ، قم بزرع 1 مل من الخلايا على أغطية في 24 لوحة بئر. لفحوصات إطلاق LDH ، قم بزرع 100 ميكرولتر من الخلايا في صفيحة مكونة من 96 بئرا. بالنسبة لمقايسة LDH ، قم ببذور 9 آبار (3 آبار غير معالجة ، و 3 آبار مع ضوابط تحلل بنسبة 100٪ ، و 3 آبار للتحفيز التجريبي).
- قم بالطرد المركزي للوحة 96 بئرا لمدة 5 دقائق عند 300 × جم للتأكد من توزيع الخلايا بالتساوي عبر البئر.
- احتضن اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية + 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 قبل بدء عملية التحضير.
< p class = "jove_title" >
2. فتيلة
- استبدل الوسط بوسط جديد (DMEM-5) يحتوي على 100 نانوغرام / مل LPS (500 ميكرولتر للصفيحة المكونة من 24 بئرا أو 50 ميكرولتر للوحة 96 بئرا).
ملاحظه: هناك مجموعة متنوعة من الاختلافات الهيكلية في LPS ، والتي تؤثر على القدرة على تحفيز التحضير بوساطة TLR4. LPS من Salmonella minnesota R595 (Re) متاح من بائعين متعددين ويوصى به.
- احتضان اللوحة لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
< p class = "jove_title" >
3. تنشيط NLRP3 Inflammasome مع النيجيريسين
- قم بإزالة الوسط واستبدله ب 290 ميكرولتر من DMEM-5 يحتوي على 5 ميكرومتر من النيجيريسين و 5 ملي مولار جلايسين. يضاف الجلايسين لتقليل كمية تحلل الخلايا التي تحدث أثناء تنشيط كاسباز -1. احتضان لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. استخدم كلا من البلاعم الناقصة من النوع البري وكاسباز -1 للتأكد من أن الملصقات المرصودة خاصة ب caspase-1.
- بعد 60 دقيقة ، قم بإزالة الوسط واغسل الخلايا ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها 1 مل من PBS البارد.
فئة < p = "jove_title" >
4. تلطيخ الأجسام المضادة
ملاحظة: لتسمية الخلايا بالأجسام المضادة للكشف عن ASC والبذور والأولية وتعريض الخلايا للنيجيريسين المطابق للقسم السابق. المعالجة بعد ذلك هي كما يلي:
- اغسل الخلايا ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها 1 مل من PBS البارد. أضف 250 ميكرولتر من محلول التثبيت والنفاذية. احتضن الخلايا على الجليد ، وقم بتغطيتها لمدة 30 دقيقة.
- اغسل البلاعم ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها 1 مل من محلول الغسيل.
- أضف 250 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية ضد ASC المخفف 1: 500 في مخزن الغسيل واحتضانه لمدة ساعة واحدة على الجليد. قم بتضمين غطاء واحد لا يتلقى أي جسم مضاد أولي ، ولكنه سيتلقى الثانوي فقط. سيتم استخدام هذا الغطاء أثناء إعداد المجهر لتعيين الإزاحة الصحيحة.
- اغسل الخلايا ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها بمحلول غسيل 1 مل.
- أضف 250 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي (صبغة الفلورسنت المصاحبة للماعز المضاد للفأر) المخفف 1: 500 في مخزن الغسيل واحتضانه لمدة ساعة واحدة على الثلج. أضف 4 ميكرولتر من 0.2 ملي مولار بقعة الحمض النووي الفلوري الأحمر الفاتح لمدة 5 دقائق الأخيرة من هذه الحضانة لتسمية النوى.
- اغسل الخلايا 3 مرات باستخدام 1 مل من محلول الغسيل البارد وقم بتركيب الغطاء على شرائح المجهر باستخدام وسيط تثبيت مضاد للبهتان سعة 7 ميكرولتر. دع وسط التثبيت يتماسك طوال الليل قبل إغلاق الغطاء على شريحة المجهر باستخدام طلاء أظافر شفاف.
- صورة البلاعم عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر. Ex / Em للجسم المضاد الثانوي هو 555/580 نانومتر و 642/661 لصبغة الحمض النووي الفلوري الأحمر البعيد.