اختبار إطلاق نازعة هيدروجين اللاكتات للكشف عن موت البلاعم بعد التعرض للنيجريسين

الملخص

المصدر: den Hartigh، AB et al.، الكشف عن تنشيط الالتهاب وموت الخلايا الحمى في البلاعم المشتقة من نخاع عظم الفئران. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو مقايسة نازعة هيدروجين اللاكتات للكشف عن موت البلاعم بوساطة الالتهاب. تتعرض البلاعم لعديدات السكاريد الدهنية للتحضير ، يليها التعرض للنيجيريسين للتسبب في موت الخلايا الناجم عن الالتهابات ، والذي يتم تحديده بواسطة مقايسة نازعة هيدروجين اللاكتات.

البروتوكول

1. مقايسة إصدار LDH

ملاحظة: لمقايسة إطلاق LDH ، قم بزرع الخلايا في صفيحة 96 بئرا. لا تقم بإزالة الوسيط بعد التحضير.

1. استبدل الوسط بوسط جديد (DMEM-5: 10 مل من DMEM الخالي من الفينول الأحمر + 5 ملي مولار HEPES + 0.2 ملغم / مل لتر جلوتامين + 0.05 ملي مولار 2-ميركابتو إيثانول + 5٪ FBS) تحتوي على 100 نانوغرام / مل LPS في الآبار التي تحتوي على خلايا ضامة ملتصقة (500 ميكرولتر للألواح المكونة من 24 بئرا أو 50 ميكرولتر للألواح المكونة من 96 بئرا).
   ملاحظه: هناك مجموعة متنوعة من الاختلافات الهيكلية في LPS ، والتي تؤثر على القدرة على تحفيز التحضير بوساطة TLR4. يوصى باستخدام LPS من السالمونيلا المينيسوتا R595 (Re).
2. احتضان اللوحة لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
3. أضف 50 ميكرولتر من DMEM-5 يحتوي على 10 ميكرومتر من النيجيريسين إلى الآبار التجريبية و 50 ميكرولتر DMEM-5 إلى آبار التحكم التلقائي و100٪ للتحكم في التحلل. احتضان لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
4. بعد 30 دقيقة ، أضف 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتحلل 10x إلى آبار التحكم في التحلل بنسبة 100٪ وأضف 10 ميكرولتر من DMEM-5 إلى الآبار الأخرى. أثناء هذه الحضانة ، قم بإزالة قارورة واحدة من مزيج الركيزة (1.5 مل من الركيزة المجففة بالتجميد) و 1 كمية من المخزن المؤقت للفحص (~ 12 مل) من الفريزر واتركها تذوب محمية من الضوء إلى درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظه: يحتوي مزيج الركيزة على ملح تيترازوليوم (iodonitrotetrazolium violet) ، والذي يتم تحويله إلى منتج فورمازان أحمر.
5. بعد الحضانة الإجمالية لمدة 60 دقيقة ، قم بالطرد المركزي للوحة لمدة 5 دقائق عند 500 × جم عند 10 درجات مئوية. انقل 50 ميكرولتر من المادة الطافية إلى صفيحة شفافة ذات قاع مسطح. خلال هذا الوقت ، أضف 12 مل من المخزن المؤقت للفحص إلى قارورة مزيج الركيزة واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق قبل الاستخدام.
6. أضف 50 ميكرولتر من الركيزة إلى كل بئر واحتضن لمدة 30 دقيقة في الظلام. قم بتضمين الآبار المتوسطة فقط للقيم الفارغة. افحص اللوحة بعد 15 دقيقة للتأكد من أن الإشارة لن تتجاوز حد الكشف عن قارئ اللوحة.
7. بعد 30 دقيقة ، أضف 50 ميكرولتر من محلول التوقف (1 M حمض الخليك) وقم بقياس OD₄₉₀ باستخدام قارئ لوحة.
8. احسب النسبة المئوية لتحلل الخلية باستخدام الصيغة التالية:
   النسبة المئوية للسمية الخلوية = ((تجريبية - عفوية) / (الحد الأقصى - تلقائي))×100
   تجريبية: الخلايا المعالجة بالنيجيرسين. عفوية: الخلايا غير المعالجة. الحد الأقصى: الخلايا المعرضة للمخزن المؤقت للتحلل.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Cytotox96 مقايسة السمية الخلوية غير المشعة فيشر ساينتيك PR-G1780 يتضمن مزيج الركيزة ومخزن الفحص ؛ تركيبات خاصة. محلول التوقف هو 1 م حمض الخليك DMEM، نسبة عالية من الجلوكوز، بدون جلوتامين، بدون أحمر الفينول إنفيتروجين 31053028 Dulbecco's PBS ، خال من الكالسيوم ، بدون مغنيسيوم إنفيتروجين 14190144 مصل الأبقار الجنينية، مؤهل، أمريكي المنشأ إنفيتروجين 26140079 يتم تعطيل الحرارة عند 55 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة الجنتاميسين إنفيتروجين 15750060 LPS فائق النقاء من السالمونيلا المينيسوتا R595 (إعادة) قائمة البيولوجية 434 قارئ لوحة Spectramax M3 الأجهزة الجزيئية 5000414 ل-جلوتامين إنفيتروجين 21051024