تحريض وتصور مصائد العدلات خارج الخلية في العدلات المسماة مسبقا

الملخص

المصدر: Arends ، E. J. et al. ، اختبار عالي الإنتاجية لتقييم وتحديد تكوين مصيدة العدلات خارج الخلية.J. Vis. Exp.(2019)

يوضح هذا الفيديو تحريض وتصور مصائد العدلات خارج الخلية أو NETs في العدلات المسماة مسبقا باستخدام مصل المريض الذي يحتوي على أجسام مضادة للسيتوبلازم مضادة للعدلات. علاوة على ذلك ، يتيح استخدام صبغة الحمض النووي غير المنفذة والفحص المجهري الفلوري تصور NETs.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

< p class = "jove_title" >1. عزل العدلات السليمة

1. الحصول على 20 مل من الدم المحيطي من متبرع سليم في أنبوبين مغلفين بحمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) سعة 10 مل.
2. ضع 10 مل من الدم في أنبوب معقم سعة 50 مل وأضف المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) حتى 32.5 مل.
3. أضف تدرج الكثافة (على سبيل المثال ، Ficoll-amidotrizoaat) تحت الخلايا.
   1. خذ 14 مل من تدرج الكثافة باستخدام وحدة تحكم في الماصة والماصة سعة 10 مل.
   2. ضع الماصة في الجزء السفلي من الأنبوب سعة 50 مل.
   3. انزع وحدة التحكم في الماصة من الماصة ، مما يسمح لتدرج الكثافة بالتدفق خارج الماصة عن طريق الجاذبية حتى يتم الوصول إلى الحد الأقصى عن طريق التأثير الشعري (سيتم ترك 1-2 مل ) ، دون استخدام المحرك.
   4. قم بإزالة الماصة عن طريق وضع إبهام أعلى الماصة ، وبالتالي منع تدرج الكثافة من التسرب أثناء إزالة الماصة.
4. قم بتدوير الأنابيب لمدة 20 دقيقة عند 912 × جم ودرجة حرارة الغرفة (RT) بدون تسارع أو فرامل.
   ملاحظة: خلايا الدم الحمراء (RBC) والعدلات لها كثافة عالية وتقع في قاع أنبوب 50 مل. يتم فصل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) وفوق تدرج الكثافة كحلقة بيضاء. ستكون البلازما المخففة ب PBS فوق PBMCs. إذا لزم الأمر ، يمكن عزل PBMCs عن طريق نقل الحلقة البيضاء إلى أنبوب جديد سعة 50 مل مع خطوات غسيل إضافية باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
5. قم بإزالة الحلقة البيضاء التي تحتوي على PBMCs بعناية أولا ، متبوعة بإزالة البلازما المخففة ب PBS ، وأخيرا طبقة تدرج الكثافة قدر الإمكان.
6. لعزل العدلات من خلط العدلات / كريات الدم الحمراء ، تحلل كريات الدم الحمراء بالماء المقطر البارد المعقم.
   1. خذ زجاجة ماء مقطر معقمة باردة وقارورة PBS مركزة 10x من الثلاجة.
   2. اعمل بسرعة لهذه الخطوة. أضف 36 مل من الماء المقطر البارد والمعقم مباشرة فوق الحبيبات واخلطها مرة واحدة بعناية. أضف 4 مل من 10x PBS بعد 20 ثانية لعمل محلول متساوي التوتر. تخلط مرة واحدة بعناية.
   3. أنبوب الدوران لمدة 5 دقائق عند 739 × جم و 4 درجات مئوية (لإزالة كرات الدم الحمراء). ستكون العدلات في الحبيبات البيضاء.
   4. تخلص بعناية من المادة الطافية قم بتنفيذ الخطوة 1.6.2 مرة أخرى وتأكد من تعليق الحبيبات بشكل صحيح.
   5. أنبوب الدوران لمدة 5 دقائق عند 328 × جم و 4 درجات مئوية.
   6. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الحبيبات في 5 مل من PBS. عد العدلات واحتفظ بها على الجليد.
      ملاحظة: العائد المتوقع من أنبوب دم واحد (10 مل) هو حوالي 15-75 مليون عدلات.

< p class = "jove_title" >2. وضع العلامات على الخلايا الفلورية الحمراء للعدلات

1. اصنع معلقا عدليا من 10-20 مليون عدلات في 2 مل من PBS في أنبوب سعة 15 مل.
2. اصنع محلولا من 2 مل PBS مع 4 ميكرولتر من رابط الخلايا الفلورية الحمراء 2 ميكرومتر (انظر جدول المواد) في أنبوب مختلف سعة 15 مل. أضف هذا برفق إلى تعليق العدلات واخلطه بعناية.
3. احتضن في الظلام لمدة 25 دقيقة بالضبط عند 37 درجة مئوية لتسمية العدلات برابط الخلايا الفلورية الحمراء.
4. قم بإلغاء تنشيط الملصق عن طريق إضافة معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 الوسط الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني معطل للحرارة (FBS) عند RT حتى 15 مل واخلطه مرة واحدة بعناية. تأكد من إعادة تعليق الحبيبات بعناية إذا تشكلت حبيبات.
5. أنبوب الدوران لمدة 5 دقائق عند 328 × جم و RT.
6. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في 5 مل من وسط RPMI 1640 الخالي من الفينول الذي يحتوي على 2٪ FBS و 10٪ بنسلين / ستربتومايسين (P / S) في RT. عد العدلات.
   ملاحظه: يمكن أن يحدث فقدان للخلية بنسبة 50٪ بعد وضع العلامات على الخلايا الفلورية الحمراء.

< p class = "jove_title" >3. تحريض تكوين مصيدة العدلات خارج الخلية

1. اصنع معلقة خلية 0.42 × 10⁶ خلايا / مل في وسط RPMI 1640 الخالي من الفينول الأحمر يحتوي على 2٪ FBS و 10٪ P / S.
2. أضف 37,500 عدلات في 90 ميكرولتر لكل بئر في صفيحة سوداء ذات قاع مسطح 96 بئر.
3. أضف 10 ميكرولتر من المنبه المختار (على سبيل المثال ، مصل المريض) في ثلاث نسخ للوصول إلى تركيز 10٪ في البئر. قم دائما بتضمين عنصر تحكم سلبي (متوسط) في ثلاث نسخ.
4. احتضان في الظلام عند 37 درجة مئوية للوقت المطلوب ، والذي يتراوح من 30 دقيقة إلى 2 أو 4 أو 6 ساعات. يقترح الحضانة لمدة 4 ساعات.
5. احسب الحجم اللازم لإضافة 25 ميكرولتر من صبغة الحمض النووي غير المنفذة 5 ميكرومولار (انظر جدول المواد) ، للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 1 ميكرومتر في البئر. قم بإجراء تخفيف مسبق إذا لزم الأمر ، في وسط RPMI 1640 يحتوي على 2٪ FBS و 10٪ P / S للحصول على تركيز 5 ميكرومتر.
6. أضف 25 ميكرولتر من صبغة الحمض النووي غير المنفذة 5 ميكرومتر قبل 15 دقيقة من نهاية وقت الحضانة. استمر في الحضانة لمدة 15 دقيقة أخرى عند 37 درجة مئوية في الظلام.
7. قم بإزالة المادة الطافية (~ 125 ميكرولتر) بعناية فائقة وقم بتخزينها إذا لزم الأمر. أضف 100 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهايد (PFA). ابق في الظلام ، وتابع على الفور الخطوة 4.

فئة

4. تصور مصائد العدلات خارج الخلية (NET) مع الفحص المجهري متحد البؤر المناعي عالي المحتوى وعالي الدقة ثلاثي الأبعاد

1. قم بتكوين الإعدادات على المجهر متحد البؤر المناعي الفلوري بالنقر فوق إعداد الاستحواذ.
   1. انقر فوق علامة التبويب تكوين.
   2. حدد الهدف والكاميرا. اختر هدف 10X Apo Lambda مع وضع الاستحواذ على ثقب متحد البؤر 60 ميكرومتر.
   3. انقر فوق اللوحة واختر اللوحة البلاستيكية ذات 96 بئرا. حدد المواقع المراد زيارتها واختر عددا ثابتا من المواقع. املأ 3 أعمدة و 3 صفوف بدون تداخل (0 ميكرومتر) ، والتي تغطي ما مجموعه 45٪ من البئر.
   4. انقر فوق اكتساب. حدد تمكين التركيز البؤري المستند إلى الليزر. حدد الحصول على Z Series/Time Series إذا لزم الأمر.
   5. انقر فوق التركيز التلقائي للموقع.
      1. انقر فوق التركيز على قاع اللوحة | إزاحة حسب سمك القاع. لكي يجد البئر الأولي العينة ، اختر البئر الأول الذي تم الحصول عليه. بالنسبة للتركيز التلقائي للموقع الإلكتروني، اختر جميع المواقع.
   6. انقر فوق الأطوال الموجية.
      1. بالنسبة لعدد الأطوال الموجية ، اختر 2. بالنسبة لمستوى تحسين تصحيح التظليل TL ، اختر 2.
      2. بالنسبة إلى الطول الموجي 1، حدد Texas Red.
         1. بالنسبة لخيارات التركيز البؤري التلقائي ، حدد الليزر مع إزاحة Z ، إزاحة الليزر اللاحقة 1.1 ميكرومتر. استخدم Z-stack مع نطاق مخصص من 200-10.
      3. بالنسبة للطول الموجي 2 ، حدد الفلوريسين إيزوثيوسيانات (FITC).
         1. بالنسبة لخيارات التركيز البؤري التلقائي ، حدد الليزر مع إزاحة Z من w1 0 μm. استخدم Z-stack مع نطاق مخصص من 200-10.
         2. بالنسبة لخيارات الاستحواذ، حدد السلسلة Z وصورة الإسقاط ثنائية الأبعاد كحد أقصى. للحصول على خيارات الاستحواذ، حدد تصحيح التظليل | إيقاف.
   7. حدد Z Series. حدد عدد الخطوات: 10. حدد حجم الخطوة: 3 ميكرومتر (سيكون النطاق الإجمالي 27 ميكرومتر).
2. ضع اللوحة في الفحص المجهري متحد البؤر المناعي.
   1. انقر فوق علامة التبويب تشغيل.
      1. املأ اسم اللوحة ووصفها واختر موقع التخزين.
      2. حدد الآبار التي يجب الحصول عليها.
3. اختر وقت التعرض ل Texas Red و FITC.
4. انقر فوق Acquire Plate لبدء عملية الاستحواذ ، والتي ستستغرق حوالي 1 ساعة لكل لوحة.

< p class = "jove_title" >5. تحليل تكوين NET

1. استخدم برنامج معالجة الصور المصمم لتحليل الصور العلمية متعددة الأبعاد (انظر جدول المواد) لتحليل تكوين NET.
2. انقل بيانات الصورة التي تم الحصول عليها إلى محرك أقراص ثابت منفصل.
3. حدد أداة إضافة الألوان.
   1. حدد w1 واختر المجلد الموجود في القرص الصلب حيث يتم تخزين البيانات.
   2. حدد w2 واختر المجلد الموجود في القرص الصلب حيث يتم تخزين البيانات.
      ملاحظه: استخدم ماكرو قياسي يستخدم w1 في اسم الملف لإضافة لون أحمر إلى صور Texas Red ويستخدم w2 لإضافة لون أخضر إلى صور FITC.
4. حدد تحليل الماكرو.
   1. حدد w1، واختر قيمة الحد (حد الشدة)، والتي عادة ما تكون 10. حدد قيمة البكسل المطلوبة (حد الحجم، على سبيل المثال، 100).
   2. حدد w2، واختر قيمة العتبة (حد الشدة)، والتي عادة ما تكون 10. حدد قيمة البكسل المطلوبة (حد الحجم ، على سبيل المثال ، 500).
   3. اختر وجهة ملف جدول البيانات، وقم بتشغيل التحليل، واحفظ ملفات السجل بعد ذلك.
5. تحليل البيانات في جدول بيانات.

المواد