عزل الدهون عن العدلات المشتقة من الدم البشري عن طريق الفصل ثنائي الطور

الملخص

المصدر: Brogden، G.، et al. طرق لدراسة التغيرات الدهنية في العدلات والتكوين اللاحق لمصائد العدلات خارج الخلية. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو عزل الدهون عن العدلات البشرية بواسطة نظام مذيب ثنائي الطور باستخدام الميثانول والكلوروفورم.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. عزل الدهون وتحليل العدلات المشتقة من الدم البشري

1. خذ العدلات وضعها على الجليد.
2. على الجليد ، قم بتقطيع العدلات (الموجودة في محلول الميثانول والكلوروفورم) إلى أنبوب زجاجي لولبي سعة 15 مل مع مانع تسرب من البولي تترافلورو إيثيلين (PTFE) وتجانسها عن طريق الرج لمدة 1 دقيقة. استخدم الأنابيب الزجاجية لمنع الدهون من الالتصاق بالأسطح البلاستيكية. استخدم أغطية PTFE لمنع التلوث من المطاط / البلاستيك.
3. أضف 2 مل من الميثانول متبوعا بعد دقيقة واحدة ب 1 مل من الكلوروفورم. رج العبوة مرة أخرى لمدة 1 دقيقة.
4. قم بتدوير الأنابيب الزجاجية عند RT و 50 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
5. قم بتحبيير جزء البروتين عن طريق الطرد المركزي للمحلول عند 7 درجات مئوية و 1,952 × جم لمدة 10 دقائق.
صب
6. المادة الطافية بعناية في أنبوب زجاجي جديد سعة 15 مل ، تاركا الحبيبات المحتوية على البروتين وراءها. قم بتخزين الحبيبات عند -20 درجة مئوية للقياس الكمي في المستقبل.
7. أضف 1 مل من الكلوروفورم ، وانتظر دقيقة واحدة ، وأضف 1 مل من الماء المقطر المزدوج ، واقلب أنبوب الغطاء اللولبي الزجاجي مع العينة لمدة 30 ثانية.
8. جهاز طرد مركزي عند 7 درجات مئوية و 1،952 × جم لمدة 10 دقائق وتخلص من المرحلة العليا ، وصولا إلى الطبقة الغائمة ، ولكن ليس بما في ذلك.
9. إذا لزم الأمر، قم بإجراء خطوة تنقية إضافية اختيارية بتكرار الخطوة 1.1.8.
10. جفف العينات في مكثف مفرغ عند 60 درجة مئوية وقم بتخزينها عند -20 درجة مئوية لحين الحاجة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات حقنة 10 ميكرولتر هاملتون 701 NR 10 ميكرولتر قنية 26 جرام براون 4657683 كلوروفورم كارل روث 7331.1 ميثانول كارل روث 7342.1 الماء كارل روث 3255.1 خال من السموم الداخلية