اختبار إطلاق نازعة هيدروجين اللاكتات للكشف عن عدوى المستخفيات الحديثة في البلاعم

الملخص

المصدر: Ball ، B. ، et al. سير عمل البروتينات الكمية الخالية من الملصقات للتفاعلات المضيفة الممرضة المدفوعة بالاكتشاف. J. Vis. Exp. (2020)

في هذا الفيديو ، نوضح فحص السمية الخلوية لتقييم Cryptococcus neoformans ، وهو فطر ممرض ، عدوى في الضامة. يتم تحديد السمية الخلوية عن طريق إطلاق إنزيم نازعة هيدروجين اللاكتات السيتوبلازمية بسبب تحلل البلاعم الناجم عن عدوى Cryptococcus neoformans.

البروتوكول

1. التحقق من العدوى

ملاحظة: باستخدام مقايسة السمية الخلوية ، يمكن قياس كفاءة العدوى. سيسلط البروتوكول التالي الضوء على تطبيق منتج السمية الخلوية لقياس LDH (نازعة هيدروجين اللاكتات) الإفرار. يمكن أيضا استخدام منتجات السمية الخلوية الأخرى

1. تحضير عدوى C. neoformans لخلايا البلاعم
   1. تحضير الخلايا الفطرية
      1. باستخدام مخزون الجلسرين ، قم بربط النمط البري C. neoformans السلالة (H99) على صفيحة أجار ببتون سكر العنب (YPD) المستخرجة من الخميرة لعزل المستعمرات الفردية.
      2. احتضان طوال الليل لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثابتة.
      3. حدد مستعمرة واحدة من النوع البري C. سلالة وزراعة الخلايا النيوفورمانية في 5 مل من مرق YPD في أنبوب اختبار 10 مل مغطى بشكل فضفاض. أداء في أربع مرات.
      4. احتضان طوال الليل لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
      5. في اليوم التالي ، تزرع كل ثقافة ليلية في تخفيف 1: 100 إلى 3 مل مرق YPD.
      6. قياس قيم الكثافة الضوئية (OD_600nm) للثقافة الفطرية لتحديد مرحلة منتصف السجل. اعتمادا على مقياس الطيف الضوئي ، C. neoformans تصل السلالة البرية من النوع البري إلى مرحلة منتصف السجل عادة بعد الحضانة من 6 إلى 8 ساعات في YPD بقيم OD_600nm العامة التي تتراوح من 1.0 إلى 1.5.
      7. بمجرد أن تصل الخلايا إلى مرحلة منتصف السجل ، خذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلايا الفطرية في أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف سعة 1.5 مل وقم بتخفيف 1: 100 في محلول ملحي معقم 1x مخزن بالفوسفات (PBS). احسب عدد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.
      8. اجمع خلايا الطرد المركزي عند 1,500 × جم لمدة 10 دقائق ، واغسل الحبيبات برفق باستخدام PBS معقم بدرجة حرارة الغرفة ، وكرر ذلك لمدة ثلاث غسلات.
      9. أعد تعليق الخلايا في وسط زراعة الخلايا الخالي من المضادات الحيوية لتحقيق تركيز 1.2 × 10⁸ خلايا / مل.
   2. تحضير خلايا البلاعم
      1. تصور كل بئر في الصفيحة المكونة من 6 آبار للتأكد من أن الخلايا قد وصلت إلى 70-80٪ من التقاء. بدلا من ذلك ، يمكن قياس الخلايا لتحقيق حوالي 1.2 × 10⁶ خلايا ضامة لكل بئر.
      2. دافئ مكمل بالمضادات الحيوية وسط إلى 37 درجة مئوية قبل عمل زراعة الخلايا. تأكد من تعقيم بيئة العمل قبل عمل زراعة الخلايا. تصور الخلايا باستخدام المجهر الضوئي للتأكد من أن الخلايا ملتصقة وصحية.
      3. قم بإزالة وسط زراعة الخلايا من الطبق إما باستخدام ماصة مصلية أو شفاط فراغ.
      4. أضف برفق 5-7 مل من PBS المعقم بدرجة حرارة الغرفة (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) إلى الطبق مقاس 60 × 15 مم.
      5. قم بإمالة الطبق برفق لغسل الخلايا الملتصقة.
   3. الزراعة المشتركة ل C. neoformans وخلايا البلاعم
      1. أضف 1 مل من الخلايا العالقة C. neoformans إلى 4 آبار تحتوي على خلايا البلاعم.
         ملاحظه: يجب حساب عدد اللوحات المطلوبة قبل بدء التجربة. أضف 1 مل من الوسط الخالي من المضادات الحيوية لتفريغ الآبار.
      2. اسمح للخلايا بالتحضين عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 3 ساعات.
      3. قم بإزالة وسط زراعة الخلايا من اللوحة إما باستخدام ماصة مصلية أو شفاط فراغ.
      4. أضف برفق 1 مل من PBS المعقم بدرجة حرارة الغرفة.
      5. قم بإمالة اللوحة برفق لغسل الخلايا خارج الخلية غير الملتصقة أو غير البلعمة.
      6. أضف 1 مل من الوسط الخالي من المضادات الحيوية إلى كل بئر في الطبق المكون من 6 آبار.
      7. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
   4. في نقاط زمنية محددة (على سبيل المثال ، 1 و 3 و 6 و 12 و 24 ساعة) ، قم بجمع المادة الطافية لقياس إطلاق LDH وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   5. في نفس النقاط الزمنية ، سيتم تحلل خلايا البلاعم غير المصابة إلى قيمة محددة لتحقيق أقصى قدر من السمية الخلوية.
   6. احسب السمية الخلوية على النحو التالي:
      

المواد