نظام عدوى قائم على إدراج غشاء قابل للاختراق لدراسة تأثير السموم البكتيرية

Abstract

المصدر: Flaherty, R.A., et al. تنفيذ نظام عدوى قائم على إدراج الغشاء القابل للاختراق لدراسة آثار السموم البكتيرية المفرزة على الخلايا المضيفة للثدييات. J. Vis. Exp. (2016).

يوضح هذا الفيديو نظام عدوى قائم على إدراج غشاء قابل للاختراق لتقييم تأثير السموم البكتيرية المفرزة. من خلال القضاء على الاتصال المباشر بين العامل الممرض البكتيري والخلايا المضيفة باستخدام غشاء قابل للاختراق ، تسمح هذه التقنية بدراسة تأثير السموم التي تفرزها البكتيريا المسببة للأمراض على الخلايا المضيفة للثدييات.

Protocol

< p class = "jove_title" >1. الثقافة البكتيرية

1. توليد سلالات متساوية الجين لاستخدامها في دراسة عامل الاهتمام المفرز المحدد.
   ملاحظه: تضمنت سلالات GAS (المجموعة A Streptococcus) M1T1 5448 المستخدمة في هذه التجارب WT (النوع البري) GAS '، ونقصSLS في sagAΔ cat (الترهل = الجين المرتبط بالستربتوليسين S ، SLS = Streptolysin S) متحولة (يتم اختصارها في النص باسم ΔsagA) ، وسلالة مكملة sagA (يتم اختصارها في النص باسم ΔsagA + sagA).
2. قم بإعداد المزارع السائلة طوال الليل من السلالات البكتيرية ذات الأهمية. قم بزراعة سلالات GAS M1T1 5448 في 10 مل من مرق Todd-Hewitt عند 37 درجة مئوية لمدة 16-20 ساعة قبل إصابة الخلايا البشرية.
3. أجهزة الطرد المركزي بين عشية وضحاها المزارع البكتيرية (2,400 RCF لمدة 10 دقائق) وإعادة تعليقها في وسط بكتيري جديد.
   ملاحظه: ينتج عن إعادة التعليق في نفس الحجم الذي نمت فيه المزارع الليلية (5-10 مل) كثافة بصرية أولية مرغوبة.
4. تطبيع المزارع البكتيرية لتساوي تركيزات البداية عن طريق تخفيف الثقافات المعاد تعليقها في وسط بكتيري إضافي حتى يتم الحصول على نفس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD₆₀₀) لجميع السلالات المراد اختبارها (يوصى باستخدام OD₆₀₀ من 1.0 تقريبا للراحة).
   ملاحظه: في هذه الدراسات ، تم استخدام المزارع البكتيرية في المرحلة الثابتة لإصابة الخلايا المضيفة مباشرة بعد التطبيع. ومع ذلك ، نظرا لأن بعض سلالات البكتيريا تخرج من الطور الثابت بشكل غير متزامن ، فقد يكون من الأنسب بدء عدوى المضيف بمزارع الطور اللوغاريتمي إذا وجد أن هذا هو الحال بالنسبة للسلالات ذات الأهمية.
5. قبل إجراء مزيد من التحليل ، قم بإجراء اختبار عد المستعمرة لتحديد وحدات تشكيل المستعمرة (CFU) لكل مليلتر موجود في الثقافات الأولية بحيث يمكن تحديد تعدد العدوى (MOI) ، أو نسبة البكتيريا لكل خلية مضيفة.
   1. قم بإعداد 1 مل من التخفيفات التسلسلية للمزارع البكتيرية التي تم تطبيعها إلى الكثافة البصرية المطلوبة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) أو وسط نمو بكتيري مناسب (تم استخدام مرق تود هيويت في هذه الدراسات). قم بإعداد تخفيفات تتراوح من ^10-1 إلى ^10-6 لإنتاج مجموعة واحدة على الأقل من ألواح الأجار ذات المستعمرات القابلة للعد (30-300 مستعمرة). قم بإجراء جميع التخفيفات في ثلاث نسخ
   .
   2. انقل 100 ميكرولتر من كل تخفيف تسلسلي إلى صفيحة أجار تحتوي على الوسط المناسب للأنواع البكتيرية التي يتم تحليلها.
      ملاحظه: تم استخدام أجار تود هيويت في هذه الدراسات.
   3. استخدم موزعة بكتيرية زجاجية أو بلاستيكية لتوزيع 100 ميكرولتر بالتساوي على كامل سطح لوحة الأجار ، واستمر في الانتشار حتى يتم امتصاص السائل في الأجار. أداء تحت اللهب باستخدام تقنية معقمة.
   4. احتضان ألواح الأجار عند 37 درجة مئوية طوال الليل أو حتى تظهر مستعمرات قابلة للعد.
   5. عد المستعمرات التي تنمو على كل صفيحة واحسب CFU / ml في الثقافة الأصلية بالصيغة التالية: عدد المستعمرات × معكوس للتخفيف التسلسلي / حجم الثقافة المطلي بالملليلتر.
      على سبيل المثال (200 مستعمرة × 1 / ^10-5 تخفيف) / 0.1 مل مطلي = 2.0 × 10⁸ CFU / مل.

2. ثقافة الخلية المضيفة

1. احصل على خط خلية مضيف مناسب للتحليلات المطلوبة.
   ملاحظه: تم استخدام الخلايا الكيراتينية الظهارية البشرية HaCaT ، وهي هدية لطيفة من V. Nizet ، في هذه الدراسات.
   1. الحفاظ على خلايا HaCaT في أطباق مزرعة 100 مم في Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) مع مصل بقري جنين معطل للحرارة بنسبة 10٪ (FBS). احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.

فئة

3. عدوى الخلية المضيفة بنظام إدخال الغشاء القابل للاختراق

1. قم بوضع خلايا صفيحة في أطباق زراعة الأنسجة المناسبة واسمح لها بالنمو حتى تصل إلى 90٪ من التقاء.
   ملاحظه: عادة ما تصل خلايا HaCaT المستخدمة في هذه الدراسات إلى التقاء في غضون 2-3 أيام بعد الطلاء.
   1. لجمع المحللة (على سبيل المثال تحليل الإشارات ومقايسات تحديد أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) ، قم بلوحة خلايا HaCaT في 6 أطباق بئر بكثافة بذر تبلغ حوالي 3 × 10⁵ خلايا / بئر.
   2. بالنسبة لتجارب التصوير المناعي الفلوري ، تنزلق الخلايا الصفيحية على غطاء زجاجي معقم داخل 6 أطباق بئر بكثافة بذر تبلغ حوالي 3 × 10⁵ خلايا / بئر.
   3. لنفاذية غشاء الإيثيديوم المتجانس وفحوصات إطلاق نازعة هيدروجين اللاكتات (LDH) ، تقوم بلوحة خلايا HaCaT في 24 طبقا جيدا بكثافة بذر تبلغ حوالي 5 × 10⁴ خلايا / بئر.
2. قبل العلاج مباشرة ، اغسل الخلايا باستخدام 1x PBS معقم.
3. ضع وسط نمو جديد على الخلايا. بالنسبة للظروف الموضحة هنا ، ضع 2 مل من الوسط لكل بئر ل 6 ألواح آبار أو 0.5 مل متوسط لكل بئر ل 24 لوح بئر. إذا تم اختبار العلاجات الدوائية ، فقم بخلطها مع وسيط طازج وتطبيقها خلال هذه الخطوة.
   ملاحظة: قد تتطلب بعض المقايسات وسائط بديلة. على سبيل المثال ، نظرا لأن تركيزات الفينول الحمراء والعالية في المصل تتداخل مع مقايسة إطلاق LDH ، فقد تم استخدام وسط النسر المعدل الخالي من الفينول (DMEM) المكمل ب 1٪ ألبومين مصل البقر (BSA) (وزن / حجم) ، و 2 ملي مولار L-glutamine ، و 1 ملي مولار بيروفات الصوديوم في هذه التجارب.
4. بعد تطبيق وسط جديد ، ضع بعناية حشوة غشاء معقمة قابلة للاختراق 0.4 ميكرومتر في كل بئر. قم بتنفيذ هذه الخطوة في غطاء التدفق الصفحي ، واستخدم ملقطا معقما لنقل إدخال الغشاء المنفذ إلى كل بئر.
5. ضع وسط زراعة الخلايا الطازجة على الغرفة العلوية لكل بئر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بالنسبة للظروف الموضحة هنا ، ضع 1 مل من الوسط لكل بئر ل 6 ألواح آبار أو 0.1 مل متوسط لكل بئر ل 24 لوح بئر.
6. ضع حجما مناسبا من الثقافات البكتيرية الطبيعية (انظر القسم 1) على الغرفة العلوية لنظام إدخال الغشاء النفاذ. استخدم وسيطا بكتيريا لعلاجات المكافحة غير المصابة. بالنسبة للنتائج الموضحة هنا ، أضف 25 ميكرولتر من المزارع الطبيعية لكل غرفة ل 24 لوحة بئر و 100 ميكرولتر من المزارع لكل غرفة ل 6 ألواح آبار.
   ملاحظة: في هذه الدراسات ، تم تطبيق GAS من النوع البري أو المتحور على الخلايا المضيفة في وزارة الداخلية 10. تم حساب وزارة الداخلية بناء على الأرقام النهائية للخلايا حقيقية النواة (على سبيل المثال 2 × 10⁶ خلايا / بئر) ، بحيث تمت إضافة 10 أضعاف عدد البكتيريا لكل خلية مضيفة في بداية فترة الإصابة (على سبيل المثال 2 × 10⁷ CFU لكل بئر). ستختلف وزارة الداخلية المناسبة باختلاف الأنواع البكتيرية ومع تحليلات المتابعة المطلوبة.
   ملاحظه: بالإضافة إلى استخدام الوسط البكتيري للضوابط غير المصابة ، قد تشمل الضوابط المفيدة الأخرى لتطبيقات معينة لهذه التقنية البكتيريا المقتولة بالحرارة أو الوسط البكتيري المستهلك للمقارنة.
7. احتضان الخلايا المصابة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.

< p class = "jove_title" >4. جمع العينات

1. لجمع وسط زراعة الخلايا ، أو محللات الخلية المضيفة ، أو الأغطية الزجاجية مع الخلايا السليمة لإجراء تحليلات المتابعة ، ابدأ بإزالة حشوة الغشاء القابل للاختراق بعناية باستخدام ملقط معقم.
2. لتقييم البروتينات المضيفة المفرزة:
   1. اجمع الوسط من الغرفة السفلية إلى أنابيب سعة 1.5 مل. تجنب إزعاج الطبقة الأحادية أثناء التجميع.
   2. عينات أجهزة الطرد المركزي عند 14,000 RCF لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لإزالة الحطام الخلوي.
   3. قم بإزالة كل المادة الطافية باستثناء 50 ميكرولتر في أنبوب جديد سعة 1.5 مل واحفظها في درجة حرارة -20 درجة مئوية أو استخدمها على الفور.

Materials