الكشف عن التصاق البكتيريا بالخلايا المضيفة باستخدام التصوير الفلوري

Abstract

المصدر: Yang, J., et al. الكشف الآلي عالي الإنتاجية عن التصاق البكتيريا بالخلايا المضيفة. J. Vis. Exp. (2021)

يوضح هذا الفيديو مقايسة الالتصاق البكتيري لتقييم الالتصاق البكتيري الموسوم ب GFP بزراعة الخلايا الظهارية لدراسة ديناميكيات تفاعلات المضيف والممرض باستخدام التصوير القائم على الفحص المجهري الفلوري.

Protocol

< p class = "jove_title" >1. التصاق البكتيريا وتلوين الخلايا المضيفة

1. أولا ، اغسل الطبقات الأحادية للخلية A549 المصنفة ثلاث مرات باستخدام 1x PBS دافئ. لكل غسلة، أضف 100 ميكرولتر من 1x PBS إلى كل بئر، وقم برفع الماصة برفق لأعلى ولأسفل ثلاث مرات، وتخلص من 1x PBS أو انتظر لمدة 10 ثوان بعد الإضافة، ثم نظف بالمكنسة الكهربائية لإزالة 1x PBS. لتحديد حركية الارتباط البكتيري ، قم بتراكب الخلايا ب 100 ميكرولتر من التركيزات المرغوبة من المعلق البكتيري مع عمليات عمل مختلفة (0 و 1 و 10 و 100). قم بتدوير البكتيريا عند 200 × جم لمدة 10 دقائق واحتضان خلايا A549 المصابة عند 37 درجة مئوية ، و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 1 ساعة إضافية < br / > ملاحظه: في هذه التجربة ، كان لكل حالة ثلاث نسخ تقنية.
2. قم بإزالة البكتيريا غير المرتبطة عن طريق غسل الطبقات الأحادية خمس مرات باستخدام 1x PBS دافئ كما هو موضح أعلاه. أضف 100 ميكرولتر من الفورمالديهايد بنسبة 4٪ (في 1x PBS) في كل بئر من الألواح المكونة من 96 بئرا لإصلاح الخلايا. اترك الأطباق على الثلج لمدة 15 دقيقة ثم اغسل محلول التثبيت باستخدام 1x PBS ثلاث مرات.
3. لتلطيخ النوى ، أضف 50 نانوغرام / مل من 4 ، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) واحتضنها لمدة 10 دقائق في RT. بعد الحضانة ، اغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام 1x PBS. قم بتغطية خلايا A549 المصابة ب 100 ميكرولتر من 1x PBS لتجنب الجفاف. قم بمعالجة الخطوة التالية أو قم بتخزين الطبق على حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى يومين في الظلام.

Materials