تقنية تصوير لدراسة استجابة الكالسيوم في الخلايا المصابة بالبكتيريا

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Smail، Y.، et al. استجابات تصوير Ca²⁺ أثناء عدوى الشيغيلا للخلايا الظهارية. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو تقنية للكشف عن استجابة أيونات الكالسيوم المحلية والعالمية عند عدوى الشيغيلا للخلايا الظهارية البشرية. تغزو الشيغيلا الخلايا المضيفة وتطلق مؤثرات الغزو ، مما يؤثر على مستويات الكالسيوم داخل الخلايا. تتم دراسة سعة وتواتر الكالسيوم العصاري الخلوي المحلي والعالمي باستخدام مؤشر الفلورسنت.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. الاستعدادات

1. تحضير البكتيريا
   1. ضع البكتيريا - سلالة شيجيلا البرية التي تعبر عن التصاق AfaE (M90T-AfaE) - على صفيحة أجار من فول الصويا (TCS) تحتوي على 0.01٪ كونغو ريد (CR) واحتضنها لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية
      ملاحظه: لزيادة قابليتها للتكاثر ، يتم تخزين ألواح الشيغيلا التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.1.1 عند 4 درجات مئوية ويجب استخدامها في غضون أسبوع لأن جميع المستعمرات الموجودة على وسط CR ستتحول في النهاية إلى اللون الأحمر بمرور الوقت.
   2. تلقيح مرق TCS قبل الزراعة عن طريق قطف 3 مستعمرات حمراء من ألواح الخط.
      ملاحظه: يتم إجراء التلقيح ب 3 مستعمرات للحد من احتمالية اختيار استنساخ واحد خضع بلازميد الفوعة الخاص به لإعادة التركيب الجيني.
   3. قم بزراعة المزارع البكتيرية السائلة في حاضنة اهتزاز لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية عند 200 دورة في الدقيقة. يضاف الأمبيسلين بتركيز نهائي قدره 75 ملغم/مل. يجب ألا تتجاوز تركيزات المضادات الحيوية 3 أضعاف الحد الأدنى للتركيز المثبط ، لأن زيادة المضادات الحيوية قد تؤدي إلى فقدان البلازميد الفوعة ><الكبيرة. ملاحظه: يجب التحقق من الحفاظ على بلازميد ضراوة الشيغيلا عن طريق طلاء المزارع البكتيرية على ألواح CR المكملة بتركيزات المضادات الحيوية المناسبة. يشير وجود مستعمرات بيضاء إلى فقدان البلازميد.
   4. تلقيح ثقافة TCS بالزراعة المسبقة البكتيرية عند تخفيف 1: 100. احتضنها عند 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز لمدة ساعتين عند 200 دورة في الدقيقة. تأكد من أن الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر (OD_600nm) هي 0.2 - 0.4.
   5. الطرد المركزي للثقافة البكتيرية لمدة دقيقتين عند 13,000 × جم عند 21 درجة مئوية وأعد تعليق الحبيبات في حجم مكافئ من وسط EM (120 ملي كلوريد الصوديوم ، 7 ملي كلوريد كلوريد ، 1.8 ملي كالوريد₂ ، 0.8 ملي ملي كلوريد₂ ، 5 ملي مولار جلوكوز ، و 25 ملي مولار HEPES ، الرقم الهيدروجيني = 7.3).
   6. قم بتخفيف المعلق البكتيري في مخزن مؤقت EM عند OD_600nm نهائي قدره 0.1 واستخدمه على الفور أو قم بتخزينه عند 21 درجة مئوية واستخدمه خلال ال 60 دقيقة التالية.
2. تحضير الخلية
   1. زراعة خلايا HeLa في DMEM ب 1 جم / لتر من الجلوكوز مكملا بمصل ربلة الساق الجنينية 10٪ (FCS) وزراعتها عند 37 درجة مئوية مع 10٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}. يزرع TC-7 المزروع في DMEM مع 4.5 جم / لتر من الجلوكوز ، ويحتوي على 10٪ FCS وأحماض أمينية غير أساسية في حاضنة 37 درجة مئوية تحتوي على 10٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
   2. للحفاظ على الخلايا ، قم بتقسيم الخلايا بانتظام لتجنب تثبيط ملامسة النمو المرتبط بحالات التقاء ؛ وهذا أمر بالغ الأهمية لكفاءة تحميل / تعداء مسبار Ca²+ عالية.
   3. قم بوضع خلايا HeLa على غطاء دائري معقم بقطر 25 مم في ألواح مكونة من 6 آبار بكثافة 3 × 10⁵ خلايا / بئر في اليوم السابق لتجربة خلايا HeLa.
   4. بالنسبة لخلايا TC-7 ، قم بعمل التربسين وعد الخلايا. قم بزرعها في 4 × 10⁵ خلايا / بئر واحتضانها لمدة 5-7 أيام عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون_{بنسبة 10٪ قبل} التجارب للسماح بالاستقطاب.
      1. قم بتحديث وسط زراعة الخلايا كل يوم حتى يوم التجربة.
         ملاحظه: يمكن أيضا استخدام الغرف التي تستخدم لمرة واحدة ذات القاع الزجاجي بقطر 35 مم كبديل للآبار المحتوية على الغطاء. إذا تم استخدام هذا الأخير ، فإن التحكم في درجة الحرارة من خلال مرحلة أو هدف ساخن غير كاف ، ويلزم وجود غرفة حضانة ترموستات مثبتة على مرحلة المجهر.
3. في يوم التجربة ، قم بإزالة الوسط وغسل الخلايا 3x باستخدام 1 مل EM متوسط عند 21 درجة مئوية.
4. قم بتحميل الخلايا ب 3 ملي مولار Fluo-4 / acetoxymethyl ester (Fluo-4-AM) في مخزن مؤقت EM لمدة 30 دقيقة عند 21 درجة مئوية
   ملاحظه: في حين أن تحميل خلايا HeLa شبه المتقاربة لا يثير مشاكل كبيرة ، فإن تحميل خلايا TC-7 المستقطبة غالبا ما يكون غير متجانس وضعيف الكفاءة. بالنسبة لهذه الخلايا ، وجدنا أن كفاءة التحميل تتعزز بإضافة عامل التشتيت - حمض البلورونيك - بتركيز نهائي قدره 0.1٪ ومثبط ناقل الأنيون بروموسلفوفتالين بتركيز نهائي قدره 20 ميكرومتر إلى EM المحتوي على Fluo-4-AM. لا يتوافق استخدام المجسات الكيميائية النسبية أو مجسات FRET المشفرة وراثيا التي تتطلب اكتسابا مزدوجا مع سرعة الاستحواذ المطلوبة لتصوير استجابات Ca²⁺ المحلية.
5. اغسل العينات 3x باستخدام المخزن المؤقت EM واحتضانها في 1 مل من المخزن المؤقت EM عند 21 درجة مئوية للسماح بالتحلل المائي لجزء AM. استخدم الخلايا المحملة ب Fluo-4 على الفور أو في غضون 90 دقيقة التالية (يتم الاحتفاظ بها عند 21 درجة مئوية).

< p class = "jove_title" >2. العدوى واكتساب الصور لاستجابات Ca²⁺ المحلية

1. ضع الغطاء الذي يحتوي على الخلايا المحملة ب Fluo-4 في غرفة تصوير أو غرفة ذات قاع زجاجي. اغسل العينات في غرفة التصوير أو الغرفة ذات القاع الزجاجي التي يمكن التخلص منها 3x باستخدام المخزن المؤقت EM لإزالة المركبات التي يحتمل أن تكون ناتجة عن تحلل الخلايا. أضف 1 مل من المخزن المؤقت EM.
2. ضع الغرفة على مرحلة المجهر الفلوري المقلوب المسخن عند 33 درجة مئوية
   ملاحظه: يتم اختيار درجة الحرارة هذه كحل وسط بين درجات الحرارة المثلى المتوافقة مع عملية غزو الشيغيلا وتباطؤ استجابات Ca²⁺ لتصور الاستجابات المحلية. نستخدم هدف زيت الغمر 63X (NA = 1.25) المجهز بحلقات تباين الطور.
3. حدد حقل الفحص المجهري وقم بإعداد معلمات الاستحواذ ، بما في ذلك وقت التعرض والتجميع إذا لزم الأمر ، لتحسين إشارة الفلورسنت Fluo-4.
   ملاحظه: تتمثل التحديات الرئيسية للتصوير المحلي Ca²⁺ في السعة المنخفضة ومدة الاستجابات الصغيرة ، مما يتطلب الحصول على كل 30 مللي ثانية على الأقل. تقدم العديد من الأجهزة المقترنة بالشحنة المضاعفة للإلكترون ذات الإضاءة الخلفية (EM-CCD) أو كاميرات أشباه الموصلات التكميلية بأكسيد المعادن (C-MOS) الحساسية المطلوبة لاكتشاف استجابات Ca²⁺ المحلية باستخدام Fluo-4. تعد حساسية الكشف أيضا مشكلة مهمة في الحد من التلف الضوئي أو القطع الأثرية مثل الاستجابات التلقائية المرتبطة بالإثارة الفلورية ل Fluo-4 بتردد عال. هنا ، تم استخدام إضاءة قائمة على LED تبلغ 470 نانومتر ، مع مرشح إثارة تمرير النطاق 480 ± 40 نانومتر ، ومرشح ثنائي اللون 505 نانومتر ، وانبعاث تمرير النطاق 527 ± 30 نانومتر المستخدم بنسبة 5٪ من شدته القصوى جنبا إلى جنب مع مرشح كثافة محايدة 1.0 لتقليل هذه المشاكل في ظل تيار من عمليات الاستحواذ ذات الفترات المحدودة. تم إجراء تحليل لإشارات Ca²+ المحلية على دفعات من تدفقات 120 ثانية بشكل روتيني. في ظل ظروف الإضاءة المنخفضة هذه ، لم يلاحظ التبييض الضوئي الفلوروفوري خلال عمليات الاستحواذ لمدة دقيقتين. يمكن إجراء عمليات الاستحواذ المتتالية على نفس العينة ، بشرط استخدام حقول مختلفة. كقاعدة عامة ، يتم إجراء تيار الاستحواذ الأول في مجال التحكم في حالة عدم وجود تحفيز للبكتيريا لضمان عدم وجود استجابات تلقائية. إذا لوحظت استجابات تلقائية ، يتم غسل العينات باستخدام المخزن المؤقت EM حتى لا يتم ملاحظة أي استجابات.
4. لإضافة البكتيريا إلى العينة ، قم بإزالة 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت EM من الغرفة وأضف 500 ميكرولتر من المعلق البكتيري المحضر في الخطوة 1.1.6 للحصول على OD_{نهائي 600 نانومتر} من 0.05 ، مع العناية المناسبة لتجنب تحريك مجال الفحص المجهري المحدد ؛ تضمن الأحجام الاختلاط السليم للبكتيريا والتوزيع المتجانس للبكتيريا على عينات الخلية.
5. قم بإجراء عملية استحواذ على الإضافة البكتيرية. بدلا من ذلك ، قم بإجراء عملية استحواذ بعد 10 دقائق من الإضافة البكتيرية ، والتي تتوافق مع الوقت اللازم للبكتيريا للترسيب على الخلايا في ظل الظروف المستخدمة. في نهاية تيار الاستحواذ ، احصل على صورة تباين الطور للحقل المحدد لتصور البكتيريا التي تلامس الخلايا والكشكشة الغشائية المرتبطة بمواقع الغزو البكتيري.
6. كرر إجراء الاستحواذ كما في الخطوة 2.5 ، على فترات قابلة للتخصيص لمدة الحصول على الصور ، وحفظ الملفات ، واختيار حقل جديد لتغطية العملية برمتها.
   ملاحظة: بالنسبة للشيغيلا ، وجدنا أن تدفقات الاستحواذ كل 5 دقائق لمدة 20 دقيقة ، بعد الترسيب البكتيري لمدة 10 دقائق ، سمحت بتغطية غالبية أحداث الغزو.
7. في نهاية إجراء الاستحواذ ، أضف تركيزا نهائيا قدره 2 ميكرومتر من عينات الأيونوميسين الأيونوفورية Ca²⁺ لتحديد السعة القصوى لإشارات Ca²⁺. احصل على الصور كل 3-5 ثوان حتى استقرار الإشارة ، عادة لمدة تقل عن 10 دقائق.
8. اتبع ذلك بإضافة Ca²⁺ مخلب الإيثيلين جلايكول مكرر (β-أمينوإيثيل الأثير) -N ، N ، N ، N′ ، N′-حمض رباعي الأسيتيك (EGTA) بتركيز نهائي قدره 10 ملي مولار لتحديد إشارة التألق في حالة عدم وجود Ca²⁺. احصل على الصور كل 3 - 5 ثوان حتى استقرار الإشارة ، عادة لمدة تقل عن 10 دقائق.
   ملاحظه: نظرا للديناميكيات البطيئة نسبيا لاختلافات Ca²⁺ العالمية ، قم بإجراء عمليات الاستحواذ هذه كل 3-5 ثوان (وليس في وضع البث) ، مما يسمح بتصوير Ca²⁺ على نفس المجال المجهري أثناء العلاجات المتتالية.

< p class = "jove_title" >3. التحليل

1. عبر عن الاختلافات العصارية الخلوية Ca²⁺ بمرور الوقت كنسبة مئوية ل ΔF / F0 ، حيث يمثل ΔF تباين متوسط شدة التألق لمنطقة الاهتمام (ROI) و F0 مضان خط الأساس في نفس عائد الاستثمار ، حيث يتم طرح منطقة غير ذات صلة من المجال خالية من الخلايا.
   1. قم بإزالة مستويات التألق القاعدية لكل خلية في مجالات مختلفة ، بما يتوافق مع مستويات خط الأساس ؛ يمكن تحديد هذه المستويات بشكل لا لبس فيه بسبب التردد المنخفض والمدة القصيرة نسبيا لاستجابات Ca²⁺ المحلية في اكتساب تيار معين.
      ملاحظة: تحديد السمات اللافتة للنظر للإجابات المتعلقة بالأسئلة المطروحة والنموذج الممرض المدروس. بشكل كلاسيكي ، تؤخذ العديد من المعلمات في الاعتبار لتحليل إشارات Ca²⁺ ، بما في ذلك تردد الخلايا التي تظهر استجابات Ca²⁺ المحلية أو العالمية ، بالإضافة إلى مدة هذه الاستجابات واتساعاها وتواترها. في حالة الشيغيلا والاستجابات المحلية ، هناك جانب مهم آخر من التحليل وهو الارتباط المكاني للاستجابات بمواقع الغزو البكتيري.
2. لتحديد النسبة المئوية للخلايا المستجيبة التي تظهر استجابات عالمية أو محلية ، ارسم عائد استثمار في الخلايا ، في سلاسل زمنية تتوافق مع اختلافات شدة Fluo-4.
   1. قم بتعيين معلمات صارمة لتحديد استجابات Ca²⁺ المحلية ، مثل سعة ثلاثة أضعاف الاختلافات في الخلفية لمتوسط خط الأساس لخلية شدة التألق ، أو مدة لا تقل عن 200 مللي ثانية ، لتجنب تسجيل نتيجة إيجابية خاطئة.
      ملاحظه: كقاعدة عامة ، يمكن تمييز استجابات Ca²⁺ المحلية الصغيرة عن أي ضوضاء في الخلفية من خلال ملفها الشخصي. يجب أن يكون عائد الاستثمار كبيرا بما يكفي لدمج إشارات مضان كافية للسماح باكتشاف الاختلافات المحلية. اعتمادا على شدة اكتشاف Fluo-4 ، قد يتوافق عائد الاستثمار هذا مع دوائر بأقطار تتراوح من 2 إلى 5 ملليمتر.
   2. قم بقياس الاختلافات في متوسط شدة مضان Fluo-4 في منطقتين في منطقة مميزة من نفس الخلية ، لتحديد ما إذا كانت الاستجابات محلية أو عالم><ية. ملاحظه: يتم تسهيل تحليل عدد كبير من الخلايا من خلال استخدام برامج التصوير التي تسمح بعرض الشاشة عبر الإنترنت لاختلافات متوسط شدة التألق بمرور الوقت للمناطق المحددة. يحتوي برنامج التصوير المتاح تجاريا على مثل هذا الخيار ، ولكن يمكن أيضا إجراء ذلك باستخدام برنامج Icy المجاني ، باستخدام المكون الإضافي ROI Intensity Evolution.
   3. تحديد النسبة المئوية للخلايا التي تظهر استجابات محلية.
      ملاحظه: يتم حساب هذه النسبة المئوية من إجمالي عدد الخلايا التي تم تحليلها في مجال الفحص المجهري ، والتي يجب أن تكون بأعداد كافية لدعم الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار غير معلمي.
   4. تحديد مدة الاستجابات المحلية.
      ملاحظه: يمكن تمييز استجابات Ca²⁺ المحلية وفقا لنطاقات مدتها (أي أقل من 500 مللي ثانية ، بين 5 و 10 ثوان ، أو أكثر من 10 ثوان) وارتباطها بمواقع غزو الشيغيلا.
3. تحديد سعة الاستجابات. أولا ، قم بمعايرة الحد الأقصى لمستويات Ca²⁺ وخلفية الخلية المحددة في الخطوة 2.1.7. نظرا لأن حمل Fluo-4 قد يختلف لكل خلية ، فقم بإجراء هذه التحديدات للخلايا الفردية في هذا المجال.
   1. عبر عن سعة الاستجابات كنسبة نسبية من الاستجابة القصوى.
   2. إجراء الاختبار الإحصائي باستخدام اختبار الحياة الطبيعية ، متبوعا باختبار بارامتري لتحليل الفروق المحتملة في اتساع الاستجابات بين العينات.
   3. حدد ارتباط هذه الاستجابات بالنسبة لمواقع الغزو البكتيري من خلال توطينها مع الكشكشة الغشائية التي يسببها البكتيريا والتي تم تصورها في صور تباين الطور المقابلة.

المواد