تحليل المشابك المناعية بين الخلايا التائية البشرية وخلايا الراجي المحملة ب SEB باستخدام قياس التدفق الخلوي للتصوير

الملخص

المصدر: Wabnitz ، G. et al. ، التحليل النوعي والكمي للمشبك المناعي في الجهاز البشري باستخدام قياس تدفق التصوير. J. Vis. Exp. (2019)

يحلل هذا الفيديو تكوين المشبك المناعي بين الخلايا التائية في مستحضرات الكريات البيض غير المنقاة والمكورات العنقودية الذهبية السموم المعوية B ، خلايا الراجي المحملة ب SEB. لوحظ إثراء CD3 و F-actin في المشبك المناعي باستخدام قياس تدفق التصوير.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. تحضير الكريات البيض

1. اسحب 1 مل من الدم المحيطي من متبرع سليم (أو مريض) في حقنة هيبارينية. تأكد من الحصول على موافقة لجنة الأخلاقيات المسؤولة عن التبرع بالدم.
2. امزج 1 مل من الدم المحيطي البشري مع 30 مل من محلول تحلل ACK (150 ملي NH₄Cl ، 1 ملي مولار KHCO₃ ، و 0.1 ملي EDTA ، درجة الحموضة 7.0) في أنبوب سعة 50 مل واحتضنه لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
3. املأ الأنابيب ب PBS وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 6 دقائق.
4. كرر الخطوتين 1.2 و 1.3 حتى يصبح المادة الطافية واضحة. أخيرا ، اغسل الخلايا في PBS ، وجهاز الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 2 مل من وسط الثقافة (RPMI1640 + 10٪ FCS). احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.

2. تحميل خلايا راجي مع SEB

1. قم بإعداد أنبوبين من Falcon سعة 15 مل مع 1.5 × 10⁶ خلايا راجي لكل أنبوب. قم بتدوير الخلايا (300 × جم لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة) وتخلص من المادة الطافية.
2. أعد تعليق الخلايا في وسط متبقي (حوالي 50-100 ميكرولتر) ، وأضف 1.9 ميكرولتر (1.9 ميكروغرام) SEB ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. أضف 5 مل من وسط المزرعة ، وقم بتدوير الخلايا (300 × جم لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة) ، وأعد تعليق الحبيبات في وسط الاستزراع (RPMI1640 + 10٪ FCS) بكثافة 1 × 10⁶ خلايا / مل.

< p class = "jove_title" >3. تحريض المشابك المناعية وبروتوكول التلوين

1. ماصة 500 ميكرولتر من تحضير خلايا الراجي المحملة ب SEB في أنبوب FACS و 500 ميكرولتر من تحضير خلايا الراجي المفرغة في أنبوب FACS آخر. أضف 650 ميكرولتر من الكريات البيض إلى كل أنبوب وقم بتدوير الخلايا (300 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة). تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 150 ميكرولتر من وسط الاستزراع (RPMI1640 + 10٪ FCS). احتضن عند 37 درجة مئوية (عادة لمدة 45 دقيقة).
قم
2. بدوامة الخلايا برفق (10 ثوان عند 1,000 دورة في الدقيقة) وأضف 1.5 مل من بارافورمالدهيد (1.5٪) أثناء الدوامة لإصلاح الخلايا. أوقف التثبيت بإضافة 1 مل من PBS + 1٪ BSA. حبيبات الخلايا (300 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من PBS + 1٪ BSA بعد الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
3. بيليه (300 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة) وإعادة تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من PBS + 1٪ BSA + 0.1٪ سابونين لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لاختراق الخلايا (لوحة 96 بئر ، على شكل حرف U).
4. اغسل الخلايا في PBS + 1٪ BSA + 0.1٪ سابونين بالطرد المركزي (300 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة) وأعد تعليق حبيبات الخلية في 50 ميكرولتر من PBS + 1٪ BSA + 0.1٪ سابونين يحتوي على أجسام مضادة أو مركبات تحمل علامة الفلوروفور (CD3-PE-TxRed (1:30) ، Phalloidin-AF647 (1: 150) ، و DAPI (1: 3،000)).
5. احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة. اغسل الخلايا 3 مرات بإضافة 1 مل من PBS + 1٪ BSA + 0.1٪ صابونين. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الخلايا في 60 ميكرولتر من PBS لقياس التدفق الخلوي للتصوير.

4. الحصول على الصور باستخدام مقياس التدفق الخلوي

ملاحظة: يعتمد إجراء الحصول على الصور التالي وتحليل البيانات على قياس تدفق التصوير الخلوي باستخدام برامج مثل imagestream (IS100) و INSPIRE و IDEAS. ومع ذلك ، يمكن أيضا استخدام مقاييس التدفق الخلوي وبرامج التحليل الأخرى.

1. افتح برنامج التحليل على الكمبيوتر المتصل بمقياس تدفق التصوير الخلوي وانقر فوق تهيئة الموائع في قائمة الأجهزة. ضع الخرزات على المنفذ الأيمن عندما يطلب منك القيام بذلك.
2. قم بتحميل القالب الافتراضي من قائمة "ملف" وانقر فوق "تشغيل/إعداد". اختر الخرز من القائمة المنسدلة عرض.
3. اضبط مصباح المجال الساطع بالنقر فوق ضبط الكثافة إذا كانت القيمة المشار إليها أقل من 200.
4. قم بتشغيل روتين المعايرة والاختبار في علامة التبويب "المساعدة" بالنقر فوق "بدء الكل".
5. انقر فوق Flush / Lock / Load وقم بتطبيق العينات في المنفذ الأيسر عندما يطلب منك القيام بذلك. بعد تحميل الخلايا في مقياس التدفق الخلوي ، افتح مصنف الخلية واضبط القيم على النحو التالي: الحد الأعلى لشدة الذروة عند 1,022 لكل قناة ، والحد الأدنى لشدة الذروة عند 50 للقناة 2 (DAPI) والقناة 5 (CD3-Pe-TxR) ، والحد الأدنى للمنطقة عند 50 للقناة 1 (التشتت الجانبي) ، والحد الأعلى عند 1,500.
6. قم بتغيير طاقة ليزر الإثارة إلى 405 نانومتر (15 ميجاوات) و 488 نانومتر (200 ميجاوات) و 647 نانومتر (90 ميجاوات) في علامة التبويب الإعداد.
7. قم بتبديل القائمة المنسدلة عرض بين الخلايا والخرز لتقييم مصنف الخلية وتعديلات طاقة الليزر.
   ملاحظه: تأكد من العثور على جميع الخلايا وأزواج الخلايا في طريقة عرض الخلية والعثور على كتل الخلايا والحطام والصور ذات وحدات البكسل المشبعة في طريقة عرض الحطام عن طريق تغيير مصنفات الخلايا و/أو قوى ليزر الإثارة.
8. حدد اسم العينة وعدد الصور المراد الحصول عليها (15,000-25,000 للعينات و 500 لعناصر التحكم في التعويض) في علامة التبويب الإعداد. انقر فوق تشغيل/إعداد لبدء الاستحواذ.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مالتي فيوج 3 ر.س هيريوس RPMI 1640 لايف تكنولوجيز #11875085 500 مل FCS بان بيوتك # 3302-P101102 أنبوب البوليسترين المستدير السفلي صقر #352054 5 مل محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco سيغما د8662 ألبومين مصل الأبقار روث # 8076.3 سابونين سيغما إس 7900 بارافورمالدهيد سيجما ألدريتش #16005 حبة السرعة أمنس #400041 ميني شاكر MS1 IKA Works MS1 لوحة ميكروتيتر غرينر بيو وان #650101 96 يو السموم المعوية SEB سيجما ألدريتش S4881 دابي سيجما ألدريتش د9542 نسبة واحد إلى ثلاثة آلاف CD3-PeTxR إنفيتروجين MHCD0317 نسبة واحد إلى ثلاثين فالويدين-AF647 المجسات الجزيئية أ 22287 نسبة واحد إلى واحد وخمسين داس 100 أمنس مقياس التدفق الخلوي للتصوير افكار أمنس برمجيات ألهم أمنس برمجيات