مقايسة لدراسة تنظيم البلعمة الضامة بواسطة الخلايا الجذعية الوسيطة

الملخص

المصدر: إيفانز، جي إف، وآخرون. تنظيم الخلايا الجذعية الوسيطة لبلعمة البلاعم ؛ القياس الكمي والتصوير. J. Vis. Exp. (2021).

يوضح هذا الفيديو فحصا لدراسة تنظيم الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) لبلعمة البلاعم في ثقافة مشتركة. عند الزراعة المشتركة ل MSC مع الضامة ، تتم إضافة جزيئات زيموزان غير opsonized المقترنة بالفلوروفور الحساس للأس الهيدروجيني ليتم البلعمة بواسطة الضامة. مع زيادة البلعمة ، ترتفع شدة التألق ، مما يسمح بتحديد تنظيم نشاط البلعمة بوساطة MSC.

البروتوكول

ملاحظة: يتم تنفيذ جميع تقنيات التحضير المتوسط وزراعة الخلايا في ظل ظروف معقمة باستخدام خزانة السلامة الحيوية مع التدفق الرقائقي. وتنفذ جميع خطوات حضانة الاستزراع الموصوفة باستخدام حاضنة مصممة للحفاظ على جو 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون 2 و95٪ رطوبة.

< p class = "jove_title" >1. زراعة الخلايا

1. تحضير وسط النمو
   1. بالنسبة إلى MSC (الخلايا الجذعية الوسيطة) و LADMAC (البلاعم المشتقة من نخاع عظم الفأر ؛ مشتق من أسماء الباحثين الذين أسسوا خط الخلية: Laskin و Dower و Malech) ، أضف 50 مل من FBS و 5 مل من مزيج المضادات الحيوية / مضادات الفطريات 100x إلى 500 مل من DMEM عالي الجلوكوز (وسط النسر المعدل من Dulbecco).
   2. بالنسبة للبلاعم (MΦ)، أضف 50 مل من FBS و100 مل من وسط حالة LADMAC (محضر باتباع خطوات القسم 1.2) و5 مل من مزيج المضادات الحيوية 100x إلى 500 مل من DMEM عالي ><الجلوكوز. ملاحظه: تنتج خلايا LADMAC عامل تحفيز المستعمرة (CSF-1) الضروري لدعم نمو خلايا MΦ.
2. نشر الخلايا استعدادا للزراعة المشتركة
   1. لزرع خلايا MSC و MΦ من المخزون المجمد ، قم بموازنة 9 مل من وسط النمو المناسب المحضر في القسم 1.1 في كل من مزارع الخلايا الأربعة 100 مم المعالجة لكل نوع من الخلايا وضعها في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 15 دقيقة.
   2. في هذه الأثناء ، قم بإذابة 10⁶ خلايا مجمدة بسرعة عن طريق احتضانها في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 2-3 دقائق أو حتى تذوب تماما. بعد ذلك ، أضف خلايا MSC المذابة إلى 9 مل من وسط نمو MSC الطازج وأضف خلايا MΦ المذابة إلى 9 مل من وسط نمو MΦ الطازج في أنابيب مخروطية معقمة 15 أو 50 مل وأجهزة طرد مركزي عند 125 × جم في دوار دلو متأرجح لمدة 5 دقائق.
   3. قم بشفط المادة الطافية أو صبها وإعادة تعليق كل حبيبات في 4 مل من وسط النمو الطازج المناسب عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل. أضف 1 مل من معلق الخلية إلى كل من الأطباق الأربعة مقاس 100 مم لكل نوع من أنواع الخلايا التي تم موازنتها في الخطوة 1.2.1.
   4. أعد الأطباق مع الخلايا إلى الحاضنة. قم بتغيير الوسيط كل 2-3 أيام حتى يتماسك 70٪ -80٪.

< p class = "jove_title" >2. بذور MSC في الأطباق التجريبية ، اليوم 1

< p class = "jove_content" >ملاحظة: قبل بذر MSC ، صمم تخطيط اللوحة التجريبي المكون من 96 بئرا لقياس الطيف الضوئي الفلوري وشريحة الغرفة للتصوير الديناميكي. بالنسبة للوحة 96 بئرا ، قم بحماية الآبار التجريبية التي تحتوي على خلايا ولكن لا تستخدمها في الفحص. ضع علامة على أربعة آبار على الأقل لاستخدامها في الكاشف الفارغ (RBL). انظر الجدول 1 للحصول على مثال لقالب 96 بئر والجدول 2 للحصول على مثال لقالب شريحة غرفة 4 آبار. يوصى باستخدام ألواح سوداء أو بيضاء مكونة من 96 بئرا ذات قيعان شفافة. تعتبر شريحة الغرفة الزجاجية البورسليكات مقاس 1.5 مم هي المثالية ، ولكن يمكن تعديل عدد الغرف اعتمادا على تصميم الدراسة. يتم تضمين مخطط تدفق موجز للطرق التالية في الشكل 1.

1. عند التقاء 70٪ -80٪ ، استنشق وسط النمو من المزارع في أطباق 100 مم وأضف 5 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) لعزل MSC.
2. قم بشفط PBS ، وأضف 2 مل من 0.05٪ تريبسين / EDTA (حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك) ، وضعه في حاضنة الاستزراع لمدة 3-5 دقائق.
3. بعد 3 دقائق ، تحقق من انفصال الخلية باستخدام مجهر مقلوب. إذا تم فصل الخلايا ، فتابع إلى الخطوة التالية ؛ إذا لم يكن الأمر كذلك ، فاستمر في الحضانة لمدة 1-2 دقيقة أخرى. لا تحتضن أكثر من 5-6 دقائق.
4. أضف 5 مل من وسط النمو الطازج إلى الطبق مع الخلايا المنفصلة. اشطف الطبق باستخدام خليط التربسين / المتوسط واجمع الخلايا في أنبوب مخروطي نظيف ومعقم سعة 50 مل باستخدام ماصة مصلية معقمة.
5. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 125 × جم. قم بشفط المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 10 مل من وسط النمو الطازج عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل.
6. لحساب الخلايا ، أضف 10 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى 30 ميكرولتر من محلول تريبان الأزرق 0.4٪ في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. ثم ، ماصة 10 ميكرولتر من الخليط تحت غطاء غرفة عد مقياس الدم.
7. باستخدام مجهر المجال المقلوب أو الساطع ، بهدف 10x ، احسب الخلايا غير الملوثة (القابلة للحياة) في أربعة من مربعات 1 مم². احسب رقم الخلية باستخدام الصيغة: الخلايا / مل = عدد الخلايا / # 1 مم² مربعات × عامل التخفيف × 10⁴.
   ملاحظه: في هذا المثال ، عدد مربعات 1 مم² التي تم عدها هو أربعة ، وعامل التخفيف هو 4.
8. استخدم المعادلة C₁V₁ = C₂V₂ لحساب وإعداد تعليق 1 × 10⁵ خلية / مل. قم بإعداد 1 مل من تعليق الخلية / مل لكل عمود من اللوحة المكونة من 96 بئرا المراد ملؤها و 0.75 مل لكل غرفة من شريحة الغرفة المكونة من 4 آبار ليتم ملؤها وفقا لتصميم اللوحة.
   ملاحظه: C₁ = عدد الخلايا ، V₁ = ما يتم حسابه ، C₂ = 1 × 10⁵ ، V₂ = 5.50 مل.
9. حدد V₁ ، واطرحه من 5.50 مل المطلوب من الحجم الكلي لتحديد حجم الوسط الجديد اللازم لإعداد التعليق. أضف حجم الخلايا (V₁) من المعلق الأصلي إلى حجم الوسط الطازج ليصبح المجموع 5.50 مل مع 1 × 10⁵ خلايا / مل.
10. أضف 100 ميكرولتر من معلق 1 × 10⁵ خلية/مل إلى كل بئر من اللوحة المكونة من 96 بئرا وفقا لتصميم اللوحة باستخدام ماصة صغيرة متعددة القنوات و 530 ميكرولتر لكل من آبار شريحة الغرفة باستخدام ماصة دقيقة وفقا لتصميم اللوحة. احتضن بين عشية وضحاها.
    ملاحظه: بالنسبة لهذه التجربة ، يتم طلاء الخلايا الجذعية الجذعية في الأعمدة 1 و 2 و 3 و 6 من الصفيحة المكونة من 96 بئرا (الجدول 1) والآبار 1 و 2 من شريحة الغرفة المكونة من 4 آبار (الجدول 2). لذلك ، يتم تحضير ما لا يقل عن 5.50 مل من معلق 1 × 10⁵ خلية / مل. يتم التعامل مع MΦ عند التقاء 80٪ بوسطاء التهابيين في نفس اليوم الذي يتم فيه زرع الخلايا الجذعية الجذعية في الألواح التجريبية.

3. عزل MΦ وإعداد الثقافات المشتركة ، اليوم 2

1. قم بإزالة وسط التنشيط من خلايا MΦ واستبدله ب 5 مل من وسط النمو الطازج. اكشط برفق باستخدام رافع الخلايا واجمع الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
2. عد الخلايا باستخدام استبعاد التريبان الأزرق وقياس الدم كما هو موضح ل MSC في الخطوات 2.6-2.7.
3. باستخدام المعادلة في الخطوات 2.8-2.9 ، قم بإعداد معلقين منفصلين من 2 × 10⁵ خلايا / مل ، أحدهما به خلايا من التحكم والآخر به خلايا من مزارع MΦ المعالجة.
   ملاحظه: قم بإعداد 1 مل من تعليق الخلية / مل لكل عمود من اللوحة المكونة من 96 بئر المراد ملؤها و 0.75 مل لكل غرفة من شريحة الغرفة المكونة من 4 آبار ليتم ملؤها وفقا لتصميم اللوحة.
4. استنشق الوسط برفق من الآبار التجريبية للوحة 96 بئرا التي تحتوي على MSC. باستخدام ماصة دقيقة متعددة القنوات ، أضف 100 ميكرولتر من معلقات الخلايا المعالجة والتحكم MΦ في الآبار التجريبية المناسبة مع وبدون MSC وفقا لتصميم اللوحة. احتضن بين عشية وضحاها.
قم
5. بشفط الوسط برفق من شريحة الغرفة المكونة من 4 آبار التي تحتوي على MSC ، وباستخدام ماصة دقيقة ، أضف 530 ميكرولتر من تعليق خلية MΦ إلى الآبار المناسبة وفقا للتصميم. احتضن بين عشية وضحاها.

فئة

4. فحص البلعمة ، قراءة لوحة الفلورسنت الحركية المكونة من 96 بئر ، اليوم 3

1. تعيين معلمات الفحص
   1. في يوم الفحص ، قم بتشغيل قارئ لوحة الفلورسنت واضبط درجة حرارة النظام على الكمبيوتر على 37 درجة مئوية.
   2. افتح برنامج System Pro وتحقق من أيقونة الجهاز في الزاوية العلوية اليسرى لتحديد ما إذا كانت الأداة متصلة بالكمبيوتر. إذا كانت الدائرة الحمراء ذات الخط مرئية ، فانقر فوق رمز الأداة واختر الأداة في النافذة المنبثقة لإجراء الاتصال.
   3. حدد تجربة جديدة للوصول إلى النافذة المنبثقة مساعد إعداد اللوحة. من قائمة مساعد إعداد اللوحة، حدد تكوين إعدادات الاكتساب الخاصة بك.
   4. حدد أحادي اللون من قائمة الإعدادات للتكوين البصري. حدد FL (التألق) لوضع القراءة والحركي لنوع القراءة.
   5. في نفس نافذة التكوينات ، ضمن الفئة ، انقر فوق الأطوال الموجية ، ثم قم بتعيين عرض النطاق الترددي إلى 9 نانومتر للإثارة و 15 نانومتر للانبعاث.
   6. اضبط عدد أزواج الطول الموجي على 1. اضبط الأطوال الموجية LM1 على 510 نانومتر للإثارة وعلى 540 نانومتر للانبعاث.
   7. تابع الفئات وحدد نوع اللوحة بعد ذلك. حدد الخيار الذي يطابق نوع اللوحة المستخدمة.
      ملاحظه: من المهم أن يتطابق الاختيار مع نوع اللوحة. يتم تعيين ارتفاعات القراءة بواسطة النظام وفقا للاختيار.
   8. بعد ذلك ، حدد منطقة القراءة وقم بتمييز مساحة اللوحة المكونة من 96 بئرا المضمنة في التصميم التجريبي.
   9. حدد PMT والبصريات، واضبط كسب PMT على مرتفع وومضات لكل قراءة إلى 6. حدد المربع بجوار القراءة من الأسفل إذا كنت تستخدم لوحة ذات قاع شفاف.
   10. حدد التوقيت واضبطه على فواصل زمنية مدتها 10 دقائق على مدار 70 دقيقة.
   11. حدد اهتزاز ، وحدد مربع قبل القراءة الأولى ، واضبطه لمدة 5 ثوان. حدد مربع Between Reads واضبطه لمدة 3 ثوان. اضبط شدة الاهتزاز على كل من المنخفض والخطي.
   12. أغلق النافذة. عندما تنبثق نافذة مساعد إعداد اللوحة، حدد تكوين تخطيط اللوحة. قم بتمييز آبار BL لتصميم اللوحة وانقر فوق Plate Blank.
   13. قم بتمييز كل صف من الصفوف التجريبية ، وانقر فوق إضافة ، وقم بتسمية المجموعة ، ثم حدد لونا.
   14. ضمن خيارات التعيين أسفل تصميم اللوحة ، حدد سلسلة ، ثم حدد السلسلة في النافذة وانقر فوق موافق. كرر لكل مجموعة.
2. تحضير معلق zymosan
   1. أثناء انتظار وصول درجة حرارة النظام إلى 37 درجة مئوية ، أعد تعليق 1 مجم من جزيئات الزيموزان في 5 مل من وسط تصوير الخلية الحية.
      1. أضف 1 مل من وسيط تصوير الخلايا الحية إلى القارورة التي تحتوي على الجسيمات واجمعها في أنبوب زراعة زجاجي. اشطف القارورة ب 1 مل إضافي من محلول التصوير وانقلها إلى نفس الأنبوب الزجاجي لضمان نقل جميع الجسيمات. أضف 3 مل من محلول التصوير الإضافي لتحقيق 0.2 مجم / مل من تعليق الجسيمات.
   2. دوامة مع نبضات سريعة لمدة 30-60 ثانية. بعد ذلك ، استخدم مسبار صوتي للصوتنة مع 60 نبضة سريعة.
      ملاحظه: من المهم جدا إنشاء تعليق متجانس للجزيئات وعدم ترك التعليق يجلس لفترة طويلة قبل إضافته إلى الآبار التجريبية. يتكرر التكتل بسرعة. قد يحتاج الجسيم لكل كثافة خلية إلى التحسين اعتمادا على المصدر والمعالجة والكثافة المستخدمة MΦ. في الدراسات المقدمة ، تم استخدام جزيئات زيموزان مترافقة. ومع ذلك ، فإن الإشريكية القولونية المترافقة والمكورات العنقودية الذهبية متوفرة أيضا.
3. أضف الزيموسان واقرأ الطبق
   1. استنشق الوسط من الآبار التجريبية واشطفه 1x ب 100 ميكرولتر من محلول تصوير الخلايا الحية. اشطف آبار RBL بمحلول تصوير الخلايا الحية أيضا.
   2. استنشق محلول تصوير الخلايا الحية من الآبار التجريبية و RBL واستبدله ب 100 ميكرولتر من معلق الجسيمات الزيموزانية.
   3. افتح درج اللوحة الخاص بقارئ الفلورسنت باستخدام واجهة لوحة اللمس. ضع الطبق ، بدون الغطاء ، في الدرج مع بئر A1 في الزاوية العلوية اليسرى. أغلق الدرج باستخدام لوحة اللمس وانقر على زر القراءة الأخضر في القائمة العلوية.
   4. عند اكتمال القراءة ، احفظ الملف في المجلد المناسب وقم بتصدير البيانات بتنسيق جدول بيانات بالنقر فوق ملف وتحديد تصدير.
   5. احسب متوسط ± التألق النسبي SEM لكل مجموعة مكررة في كل نقطة زمنية (10 دقائق ، 20 دقيقة ، 30 دقيقة ، إلخ) في جدول البيانات (الملف التكميلي 1) ونقل البيانات إلى برنامج الرسوم البيانية.
   6. استخدم تنسيق الرسم البياني الخطي لتقديم البيانات وتطبيق ANOVA ثنائي الاتجاه (Time x Treatment / MSC كعوامل) متبوعا باختبار المقارنات المتعددة ل Tukey لتحديد الاختلافات بين المجموعات الفردية.
      ملاحظه: أثناء تقدم قراءة اللوحة المكونة من 96 بئرا ، قم بإعداد لوحة التصوير الديناميكية للحصول على صورة بفاصل زمني. تأكد من أن التصوير الديناميكي يستمر في تحليل بئر تجريبي واحد في كل مرة.

< p class = "jove_content" > الجدول 1: مثال على تصميم لوحة 96 بئرا. CBL - خلية فارغة ؛ MSC - اليوم المصنف 1 ؛ MΦ + معالج و MΦ غير معالج بذرة اليوم 2 ؛ تمت إضافة كاشف RBL فارغ في يوم الفحص 3.

1 2 3 4 5 6 7 أ CBL MSC / MΦ MSC / MΦ + MΦ MΦ+ CBL RBL ب CBL MSC / MΦ MSC / MΦ + MΦ MΦ+ CBL RBL ج CBL MSC / MΦ MSC / MΦ + MΦ MΦ+ CBL RBL د CBL MSC / MΦ MSC / MΦ + MΦ MΦ+ CBL RBL ه CBL MSC / MΦ MSC / MΦ + MΦ MΦ+ CBL RBL ويف CBL MSC / MΦ MSC / MΦ + MΦ MΦ+ CBL RBL ز CBL MSC / MΦ MSC / MΦ + MΦ MΦ+ CBL RBL ح CBL MSC / MΦ MSC / MΦ + MΦ MΦ+ CBL RBL < p class = "jove_content" > الجدول 2: مثال على تصميم شريحة غرفة 4 آبار. MSC - مطلي اليوم 1 ؛ MΦ + معالج و MΦ مطلي غير معالج اليوم 2.

1 2 3 4 MSC / MΦ MSC / MΦ + MΦ MΦ+

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: نظرة عامة على سير عمل مقايسة الثقافة المشتركة والبلعمة. مخطط تفصيلي لسير العمل للتحليل الكمي والنوعي لنشاط البلعمة MΦ في الزراعة المشتركة مع MSC.

الملف التكميلي 1: ملف جدول بيانات تمثيلي للبيانات الحركية الأولية من تجربة مثالية. الرجاء ال...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 96 بئر من البوليسترين الأسود Microplate MilliporeSigma CLS3603-48EA 0.4٪ محلول تريبان الأزرق MilliporeSigma T8154-20 مل 15 مل و 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطي المعقم من مادة البولي بروبيلين ثيرموفيشر 339653 مضاد حيوي مضاد للفطريات (100X) جيبكو ثيرموفيشر 15240096 رافع الخلايا MilliporeSigma CLS3008-100 إيه قوارير الاستزراع ، زراعة الأنسجة المعالجة ، مساحة السطح 75 سم 2 ، رقبة معلقة ، مع غطاء ، مفلترة MilliporeSigma C7231-120EA D1 ORL UVA [D1] ATCC رقم التعريف الهاتفي-12424 خط خلية MSC للماوس DMEM, نسبة عالية من الجلوكوز ثيرموفيشر 11965092 مصل الأبقار الجنينية، مؤهل، معطل بالحرارة ثيرموفيشر 16140071 مقياس الدم فيشر ساينتفيك 02-671-51 ب I-11.15 ATCC CRL-2470 خط خلية الماوس MΦ خط خلوي LADMAC ATCC رقم التعريف الهاتفي-2420 تفرز خلايا LADMAC عامل تحفيز مستعمرة العامل 1 (CSF-1). حل تصوير الخلايا الحية ثيرموفيشر A14291DJ برنامج تلفزيوني ، درجة الحموضة 7.4 ثيرموفيشر 10010031 درجة الحموضة رودو جرين زيموسان الجسيمات الحيوية المترافقة ثيرموفيشر ص 35365 سبيكتراماكس i3X الأجهزة الجزيئية وحدات تصفية فراغ معقمة للاستخدام الواحد ، 250 مل ، 0.2 ميكرومتر ثيرموفيشر 568-0020 مرشحات حقنة معقمة ، 0.2 ميكرومتر ثيرموفيشر 723-2520 أطباق الاستزراع المعالجة بزراعة الأنسجة، 100 مم × 20 مم MilliporeSigma CLS430167-100 أ التربسين EDTA (0.05٪) ، أحمر الفينول ثيرموفيشر 25300054