مقالة منهجية

إدخال البروتينات المستجيبة البكتيرية في خلايا الثدييات عن طريق التثقيب الكهربائي

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Sontag ، R. L. et al. ، التثقيب الكهربائي للمؤثرات البكتيرية الوظيفية في خلايا الثدييات. J. Vis. Exp. (2015)

في هذا الفيديو ، نوضح إدخال البروتينات المستجيبة البكتيرية في خلايا الثدييات عن طريق التثقيب الكهربائي. يتم الكشف عن التوطين داخل الخلايا للبروتينات المستجيبة البكتيرية عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر بعد التلوين بأجسام مضادة محددة مترافقة بالفلوروفور.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. التثقيب الكهربائي

  1. ضع 400 ميكرولتر من معلق الخلية في كوفيت مبرد مسبقا وأضف 20 ميكروغرام من البروتين المختار إلى الكوفيت (50 ميكروغرام / مل).
    2. حركي
  2. الكوفيت برفق ~ 10 مرات لخلطها دون إتلاف الخلايا. ملاحظه: يمكن أيضا قلب الكوفيت عدة مرات لخلطها جيدا ، ولكن لا تسحب لأعلى ولأسفل أو تدور لتجنب إتلاف الخلايا.
  3. جفف الجزء الخارجي من الكوفيت بمنشفة ورقية أو ممسحة أخرى لتجنب الانحناء الكهربائي في المثقوب الكهربائي.
  4. عينة التثقيب الكهربائي عند 0.3 كيلو فولت لمدة 1.5-1.7 مللي ثانية. ملاحظة: كان هذا نموذجيا لهذه الدراسة.
  5. مباشرة بعد التثقيب الكهربائي ، حركي الكوفيت برفق ~ 10 مرات لخلطها جيدا.
< p class = "jove_title" >2. طلاء الخلايا

  1. قم بتخزين الكوفيت مع الخلايا الكهربائية على الثلج حتى تصبح جاهزة لوضعها في أطباق التعافي.
  2. بالنسبة لمعظم التحليلات النهائية ، اغسل الخلايا 1x باستخدام NGM الدافئ مسبقا لإزالة البروتين المستجيب الغريب.
    1. قم بإزالة الخلايا لتحليلها وتعليقها في 3-5 مل من NGM.
    2. خلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 900 × جم لمدة 4 دقائق.
    3. قم بتعليق حجم مناسب من NGM لحجم اللوحة المطلوب (على سبيل المثال ، 2 مل لطبق 35 مم).
  3. قم بإزالة الكمية المناسبة من الخلايا لتحليلها النهائي.
    1. مثال 1: طبق في أطباق ذات قاع زجاجي لتحليل الفحص المجهري.
    2. مثال 2: صفيحة في بلاستيك زراعة الخلايا لتحليل البروتين مثل تنقية التقارب.
  4. اسمح للخلايا بالتعافي في صفائح متوازنة في جو مرطب بنسبة 95٪ هواء / 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات على الأقل.

3. تحليل الفحص المجهري

  1. التثبيت / تلطيخ التألق المناعي
    1. اغسل الخلايا 1x باستخدام PBS معقم بعد فترة نقاهة مدتها 4 ساعات.
    2. قم بإصلاح الخلايا في 100٪ من الميثانول لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. استخدم ما يكفي من الميثانول لتغطية الخلايا بالكامل (على سبيل المثال 2 مل لطبق 35 مم).
    3. اغسل 3x باستخدام PBS المعقم.
    4. تخلل الخلايا بنسبة 0.4٪ Triton X-100 في PBS لمدة 15 دقيقة. على سبيل المثال ، استخدم 1 مل للوحة قطرها 35 مم.
      1. اضبط طول نفاذية وقوة Triton X-100 وفقا للحاتمة وموقع البروتين المستهدف. ملاحظه: يجب تحديد أفضل النتائج تجريبيا لكل هدف ، ومع ذلك ، يجب أن تكون الشروط المذكورة أعلاه مناسبة لمعظم أهداف العصارة الخلوية.
    5. كتلة مع 5٪ ألبومين مصل البقر (BSA) في PBS لمدة 1 ساعة في RT. على سبيل المثال ، استخدم 1 مل للوحة قطرها 35 مم.
    6. اغسل 3x باستخدام PBS.
    7. احتضان الجسم المضاد الأساسي في محلول ربط الأجسام المضادة (0.1٪ Triton X-100 و 1٪ BSA في PBS) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية مع هزاز لطيف. على سبيل المثال ، استخدم 0.5 مل للوحة قطرها 35 مم.
      1. اتبع توصيات الشركة المصنعة لتخفيف الأجسام المضادة. ملاحظه: على سبيل المثال ، تم استخدام الجسم المضاد لعلامة الببتيد المرتبطة بالستربتافيدين (SBP-tag) عند تخفيف 1: 1,000 ، بينما تم استخدام الجسم المضاد PKN1 عند تخفيف 1: 200.
    8. اغسل 4x باستخدام PBS.
    9. احتضان الجسم المضاد الثانوي المترافق بالفلورسنت المناسب في محلول ربط الأجسام المضادة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، محمي من الضوء.
      1. على سبيل المثال ، استخدم Alexa 488 أو Alexa 647 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
        1. اتبع توصيات الشركة المصنعة لتخفيف الأجسام المضادة. (على سبيل المثال ، حوالي 1: 1,000 لهذه الدراسة).
      2. أضف بقعا أخرى حسب الحاجة ، على سبيل المثال ، 5 ميكرومتر من جنين القمح (WGA) مترافق مع Alexa 647 أو DAPI وفقا لتوصية الشركة المصنعة ، لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
    10. اغسل 5 مرات باستخدام PBS وخزنها على حرارة 4 درجات مئوية ، محمية من الضوء حتى تصبح جاهزة للتصوير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 0.25٪ محلول التربسين EDTA سيلجرو 25-050-سيلتر 0.4 سم كوفيت كهربائي يمكن التخلص منه بيو راد 165-2088 100٪ ميثانول أي غير متاح قابل للاشتعال ، سام ألبومين مصل الأبقار (BSA) سيجما ألدريتش أ 4919 جهاز عد الخلايا - مقياس الدم أو عداد كولتر بيكمان كولتر الموديل Z1 حاضنة زراعة الخلايا أي غير متاح ترطيب 95٪ هواء / 5٪ CO2 جو عند 37 درجة مئوية بلاستيك ثقافة الخلية أي غير متاح قوارير / لوحات ثقافة الخلية ، ماصات ، أنابيب ، شرطي مطاطي تعديل دولبيكو لوسط النسر (DMEM) سيلجرو 10-013 دافئ حتى 37 درجة مئوية المثقاب الكهربائي بيو راد الإشريكية القولونية النابض مصل الأبقار الجنينية (FBS) سيلجرو 35-016-السيرة الذاتية المجهر متحد البؤر الفلوري زيس الموديل LSM 710 أطباق القاع الزجاجي للفحص المجهري ويلكو ويلز إتش بي ست-3522 خط خلية هيلا ATCC ATCC CCL-2 الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM) سيلجرو 10-010 دافئ حتى 37 درجة مئوية بقع الفلورسنت الأخرى (WGA ، DAPI) جنبا إلى جنب مع الكاشف المضاد للبهتان أي غير متاح البنسلين / الستربتومايسين سيلجرو 30-002-كلتر خط خلية RAW 264.7 ATCC TIB-71 الجسم المضاد الأولي ضد الهدف محل الاهتمام أي غير متاح الجسم المضاد الثانوي المترافق مع الفلوروفور أي غير متاح محلول ملحي مخزن بالفوسفات أي غير متاح يبرد إلى 4 درجات مئوية محلول ملحي معقم بالفوسفات أي غير متاح دافئ حتى 37 درجة مئوية جهاز طرد مركزي أعلى الطاولة قادر على قبول الأنابيب المخروطية (يفضل دلو التأرجح) أي غير متاح تريتون X-100 سيجما ألدريتش تي 8585 مهيج ، سام

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Triton X 100 DAPI BSA

مقالات ذات صلة