التهاب الجلد الناجم عن الملاسيزية وتحليل العبء الفطري في نموذج الفئران

الملخص

المصدر: Sparber، F. et al.، إصابة الفئران بالملاسيزية spp. لدراسة التفاعل بين الفطريات والمضيف.J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو عدوى الجلد الناجمة عن الملاسيزية في الفئران. يتم وضع معلق زيت الملاسيزية على الأذن المصابة ، مما يؤدي إلى التهاب وتورم أنسجة الأذن. في وقت لاحق ، يتم تشريح الأذنين وتجانسهما ونشرهما على صفيحة أجار للنمو. يشير عدد المستعمرات إلى العبء الفطري الناتج عن التهاب الجلد.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. زراعة الملاسيزية في ظروف المختبر

ملاحظة: قم بتخزين جميع الكواشف والوسائط المستخدمة لهذا البروتوكول في درجة حرارة الغرفة (RT ، 20-25 درجة مئوية) ما لم ينص على خلاف ذلك ، لأن درجة الحرارة المنخفضة يمكن أن تمنع نمو الفطريات.

1. تحضير وسط ديكسون (mDixon) المعدل بالسائل لنمو الملاسيزية. لتحضير 500 مل من وسط mDixon السائل ، قم بإذابة 18 جم من مستخلص الشعير ، و 10 جم من الصفراء الثورية المجففة ، و 5 مل Tween-40 ، و 3 جم بيبتون ، و 1 مل من الجلسرين ، و 1 مل من حمض الأوليك في 500 مل H₂O المقطر (dH₂O). اضبط الوسط على درجة الحموضة 6 باستخدام حمض الهيدروكلوريك والأوتوكلاف. قم بتخزين الوسيط في RT.
2. قم بإعداد أطباق أجار mDixon عن طريق إضافة 7.5 جم أجار إلى 500 مل من وسط mDixon قبل التعقيم. قم بتبريد أجار mDixon ببطء بعد التعقيم باستخدام قضيب توجيه ولوحة تسخين مغناطيسية لتجنب التصلب الجزئي للوسط أثناء التبريد.
3. بمجرد أن يبرد الأجار إلى 50-60 درجة مئوية ، قم بتوزيع السائل في أطباق بتري في شفاط تدفق رقائقي واتركها تجف عند RT طوال الليل. < / > ملاحظه: يمكن تخزين ألواح الأجار عند 4 درجات مئوية لعدة أسابيع عند لفها وحفظها رأسا على عقب لتجنب التبخر.
4. الحصول على عزلات الملاسيزية وإحياء مخزونات الملاسيزية المجففة بالتجميد وفقا للتعليمات التي حصل عليها المقدم.
5. تلقيح 10 مل من وسط mDixon السائل في قارورة Erlenmeyer معقمة سعة 100 مل مع معلق Malassezia الذي تم إحياؤه وفقا للتعليمات التي حصل عليها المزود. احتضان المزرعة في حاضنة اهتزازية عند 30 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة.
6. افحص نمو ثقافة الملاسيزية بانتظام عن طريق التحقق من ظهور اللون الكريمي والعكارة. تعتمد حركية النمو على أنواع وسلالة الملاسيزية وقد تكون بطيئة بشكل خاص عندما يتم إحياء الملاسيزية حديثا من مخزون مجفف بالتجميد (الشكل 1 أ).
7. قم بإعداد مخزون الجلسرين عن طريق خلط 3 أجزاء من ثقافة الملاسيزية المزروعة بكثافة في وسط mDixon مع جزء واحد من الجلسرين المعقم بنسبة 99٪. ينقل خليط الملاسيزية / الجلسرين في أنابيب ذات غطاء لولبي معقم ويخزن في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
8. للتكاثر في المختبر ، قم بلوحة Malassezia من المزرعة السائلة في mDixon أو من مخزون الجلسرين المجمد على صفيحة أجار mDixon (تم إحضارها إلى RT من 4 درجات مئوية) باستخدام حلقة التلقيح. < / > ملاحظه: انقل ألواح أجار mDixon إلى RT من 4 درجات مئوية قبل الاستخدام ، لأن أجار mDixon البارد يمنع نمو الفطريات.
9. احتضان لوحة (صفائح) أجار مع الملاسيزية رأسا على عقب في حاضنة aN (غير اهتزازية) عند 30 درجة مئوية. افحص نمو مستعمرات الملاسيزية بانتظام. < / > ملاحظة: تظهر مستعمرات الملاسيزية على ألواح أجار mDixon في غضون 3-5 أيام وهي باهتة اللون الكريمي وناعمة مع ارتفاع محدب (الشكل 1 ب).
10. قم بتخزين مستعمرات الملاسيزية على أطباق أجار mDixon في RT لمدة ~ 2 أسابيع. بعد ذلك ، قم بإعداد طبق أجار mDixon جديد عن طريق خطوط الملاسيزية من مخزون الجلسرين المجمد كما هو موضح في 1.7.

< p class = "jove_title" >2. تحضير اللقاح لعدوى الملاسيزية التجريبية للفئران

1. تلقيح 10 مل من وسط mDixon السائل في قارورة Erlenmeyer معقمة سعة 100 مل مع 3-5 مستعمرات ملاسيزية فردية من صفيحة أجار mDixon (انظر الخطوة 1 ، الشكل 1 ب).
2. احتضان ثقافة الملاسيزية لمدة ~ 48 إلى 96 ساعة عند 30 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة حتى تصبح الثقافة كريمية اللون وعكرة (الشكل 1 أ). < / > ملاحظه: يعتمد الوقت اللازم لنمو الملاسيزية على أنواع الملاسيزية وسلالة وكمية الفطريات المستخدمة في التلقيح.
3. انقل 2 مل من مزرعة الملاسيزية إلى أنبوب معقم للطرد المركزي دقيق سعة 2 مل وجهاز طرد مركزي لمدة دقيقة واحدة عند 10,000 × جم.
4. تخلص من المادة الطافية واغسل الحبيبات عن طريق تعليقها في 1 مل من محلول الملح المخزن بالفوسفات (PBS). جهاز الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 1 دقيقة عند 10,000 × جم.
5. بعد الغسيل ، قم بتعليق الحبيبات في 1 مل من PBS عن طريق سحب العينات القوية وقياس الكثافة البصرية للمحلول عند 600 نانومتر (OD_A600) باستخدام مطياف. قم بتخفيف معلق Malassezia 20-50 x باستخدام PBS لقياس OD للتأكد من أن القراءة تتراوح بين 0.1 و 1.
   ملاحظه: تتراوح كثافة استزراع الملاسيزية لمدة 3 أيام بشكل عام بين 15 و 30 OD_A600 ، اعتمادا على أنواع الملاسيزية والسلالة وعلى عدد خلايا الخميرة المستخدمة في تلقيح المزرعة (الخطوة 2.1). تميل الملاسيزية إلى تكوين مجاميع ، وبالتالي ، فإن سحب العينات القوي ضروري لضمان تجانس المعلق.
6. Aliquot حجم من تعليق Malassezia في PBS يتوافق مع كثافة 4 OD_A600 في أنبوب معقم 2 مل. قم بإعداد أنبوب واحد لكل للإصابة بالعدوى.
7. الطرد المركزي الأنابيب التي تحتوي على الملاسيزية لمدة 1 دقيقة عند 10 ، 000 × جم.
8. تخلص من المادة الطافية حبيبات الملاسيزية في 200 ميكرولتر من زيت الزيتون الأصلي (المقابل 2 خلية خميرة OD_A600 / 100 ميكرولتر زيت زيتون).< / > ملاحظه: وجد أن زيت الزيتون وسيلة جيدة للعدوى الزائدة عن الجلد بالملاسيزية ، حيث أن الملاسيزية هي خميرة محبة للدهون وتعتمد على الدهون. يمتص الجلد زيت الزيتون بشكل أفضل من PBS. ومع ذلك ، اعلم أنه ليس من السهل تعليق الملاسيزية في زيت الزيتون. قم بتحسين تعليق الملاسيزية / زيت الزيتون عن طريق الدوامة. احتفظ بالتعليق عند RT حتى يتم استخدامه للعدوى.
9. قم بإعداد أنابيب بزيت الزيتون وحده للعدوى الوهمية لحيوانات التحكم.

< p class = "jove_title" >3. إصابة الفئران بالملاسيزية

1. اطلب إناث الفئران C57BL / 6 في سن 6-8 أسابيع واسمح لها بالتأقلم في منشأة التجريبية لمدة أسبوع واحد على الأقل. احسب 3-5 فئران لكل مجموعة ، بما في ذلك مجموعة التحكم غير المصابة.
2. قم بإعداد كوكتيل مخدر معقم يحتوي على 1.3 مجم / مل زيلازين و 6.5 مجم / مل كيتامين في PBS. 5 مل من كوكتيل التخدير يكفي لتخدير 20. اضبط حجم الكوكتيل وفقا لعدد المراد تخديرها.
   1. تخدير عن طريق حقن 10 ميكرولتر / غرام من وزن الجسم من كوكتيل مخدر داخل الصفاق (أي ما يعادل 65 مجم كيتامين و 13 مجم زيلازين لكل كيلوغرام من وزن الجسم) ووضع المخدرة على وسادة تسخين عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظه: عند الجرعة المحددة ، عادة ما تظل مخدرة لمدة ~ 30 - 60 دقيقة.
3. تحقق من ردود الفعل عن طريق الضغط على القدم الخلفية بالملقط للتأكد من تخدير بالكامل.
4. ضع كريم العين على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
5. اختياريا ، قم بقياس سمك الأذن لكلتا الأذنين باستخدام الفرجار (نطاق 0-5 مم). قم بقياس منطقتين مختلفتين من كل أذن واحسب متوسط سمك الأذن لكل أذن.
   ملاحظه: قياس سمك الأذن اختياري ويعتمد على سؤال البحث. ومع ذلك ، إذا تم استخدام سمك الأذن كقراءة لالتهاب الجلد ، فمن الضروري قياس سمك الأذن الأساسي قبل الإصابة. (انظر الخطوة 4).
6. اختياريا ، قم بتعطيل حاجز البشرة لجلد الأذن الظهرية عن طريق تجريد الشريط الخفيف: ضع قطعة صغيرة من الشريط يدويا على الجلد وقم بإزالتها مرة أخرى. كرر ذلك لمدة 5 جولات متتالية باستخدام قطعة جديدة من الشريط لكل جولة.
   ملاحظة: يسبب الملاسيزية التهابا جلديا أكثر وضوحا في الجلد المعطلة بالحاجز مقارنة بالبشرة غير المضطربة (الشكل 2 أ).
7. ضع موضعيا 100 ميكرولتر (2 OD_A600) من معلق الملاسيزية/زيت الزيتون على الجانب الظهري من كل أذن باستخدام ماصة معقمة. قم بتضمين مجموعة تحكم من التي يتم معالجتها بزيت الزيتون فقط (المجموعة الضابطة المعالجة بالمركبات).
   ملاحظه: قم بتدوير تعليق الملاسيزية / زيت الزيتون بقوة لضمان تعليق ملاسيزية متجانس مباشرة قبل التطبيق.
8. اترك المخدرة على وسادة التدفئة لتجنب انخفاض حرارة الجسم حتى تظهر عليها علامات الشفاء (حركة الشعيرات ، وزيادة معدل التنفس ، وما إلى ذلك).
9. حقن 200 ميكرولتر من محلول الجلوكوز المعقم والدافئ مسبقا تحت الجلد في الطية القفوية لدعم عملية التمثيل الغذائي وإعادة الترطيب. < / > ملاحظه: لتحضير محلول جلوكوز معقم بنسبة 2٪ ، قم بإذابة 1 مجم من الجلوكوز في 50 مل PBS وقم بتصفيته باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر. يمكن تخزين المحلول عند 4 درجات مئوية.
10. انقل مرة أخرى إلى قفصها.

< p class = "jove_title" >4. تحليل التهاب الجلد الناجم عن الملاسيزية

ملاحظة: يصف هذا الإجراء تحليل تورم الأذن الناجم عن الملاسيزية أثناء العدوى والذي يعمل كمعيار لالتهاب الجلد. الشرط الأساسي لتحليل تورم الأذن الناجم عن الفطريات هو قياس سمك الأذن الأساسي قبل تجريد الشريط و / أو العدوى (الخطوة 3.5).

1. تحضير غرفة الأيزوفلوران للتخدير قصير المدى للحيوانات المصابة بالملاسيزية والسيطرة عليها.
2. انقل واحدا في كل مرة إلى الغرفة وانتظر حتى يتم تخدير بالكامل.
   ملاحظه: تشمل علامات التخدير المناسب الاسترخاء التام للجسم بالإضافة إلى التنفس البطيء والثقيل (الخاصرة). راقب التخدير بعناية لأن التعرض المطول للأيزوفلوران يمكن أن يكون قاتلا.
3. أخرج من الغرفة وضعه على منديل ورقي.
4. قم بقياس سمك الأذن (الأذن) باستخدام الفرجار (النطاق 0-5 مم). قم بقياس منطقتين مختلفتين من كل أذن واحسب متوسط سمك كل أذن (انظر الخطوة 3.5).
5. انقل مرة أخرى إلى القفص.
   ملاحظه: تخدير الأيزوفلوران قصير العمر للغاية ، وتتعافى في غضون ~ 30 ثانية بعد إزالتها من غرفة الأيزوفلوران.
6. احسب الزيادة في سمك الأذن عن طريق طرح متوسط سمك الأذن الأساسي ، الذي تم قياسه قبل تجريد الشريط و / أو العدوى ، من متوسط سمك الأذن المقاس في كل نقطة زمنية بعد الإصابة.
7. ارسم القيم المحسوبة على أنها زيادة في سمك الأذن أو ، بدلا من ذلك ، كسمك إجمالي للأذن بمرور الوقت لكل أو مجموعة من (الشكل 2 ب).

< p class = "jove_title" >5. تحليل العبء الفطري في الجلد المصاب

1. قم بإعداد أنبوب طرد مركزي دقيق معقم سعة 2 مل لكل أذن يتم حصادها ، يحتوي على 0.5 مل من 0.05٪ nonidet P40 المعقم (NP40) في dH₂O وكرة فولاذية معقمة (قطر 5 مم).
2. قم بوزن الأنابيب باستخدام ميزان دقيق واكتب الوزن الدقيق.
3. القتل الرحيم للفئران عن طريق اختناق ثاني أكسيد الكربون₂.
4. قم بإزالة الأذن (الأذن) الموجودة في القاعدة ونقلها إلى الأنبوب الذي يحتوي على 0.5 مل من 0.05٪ NP40 المعقم في dH₂O ، كما هو موضح في الخطوات 5.1 - 5.2.
5. قم بوزن الأنبوب الذي يحتوي على أنسجة الأذن واحسب الوزن الفعلي لكل عينة عن طريق طرح وزن الأنبوب بدون العضو من وزن الأنبوب مع العضو.
6. قم بتجانس أنسجة الأذن لمدة 6 دقائق عند 25 هرتز باستخدام مجانس الأنسجة. تأكد من تجانس الأنسجة جيدا.
7. لوحة 100 ميكرولتر من كل عينة (المقابلة ل 1/5 من كل متجانس ، عامل التخفيف = 5) على ألواح أجار mDixon واحتضان الألواح رأسا على عقب في حاضنة 30 درجة مئوية.
   ملاحظه: يجب تعديل كمية المطلي المتجانس وفقا للحمل الفطري المتوقع. تأكد من لوحة كافية من التجانس للحصول على ما لا يقل عن 10 ولا تزيد عن 250 مستعمرة لكل لوحة للسماح بالتعداد السهل. اختياريا ، لوحة لوحات متعددة لكل عينة مع تخفيفات مختلفة من التجانس.
8. افحص نمو مستعمرات الملاسيزية بانتظام.
   ملاحظه: عادة ما تصبح المستعمرات مرئية بعد 2-3 أيام. يعتمد الوقت اللازم لنمو مستعمرات الملاسيزية على أنواع وسلالة الملاسيزية.
9. عد المستعمرات لكل طبق.
10. احسب عدد وحدات تكوين المستعمرة ، CFU / g الأنسجة باستخدام الصيغة التالية:
    CFU / g الأنسجة = (عدد المستعمرات / اللوحة) × (عامل التخفيف) / (وزن عينة الجلد بالجم).
    ملاحظه: يمكن تقييم الحد الأدنى التقريبي للكشف باستخدام الصيغة التالية: الحد الأدنى للكشف = (1 مستعمرة / لوحة) × (عامل التخفيف) / (متوسط وزن جميع عينات الجلد بالجم).
11. عادة ما يتم رسم الأحمال الفطرية على مقياس لوغاريتمي (الشكل 2 ج).

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: زراعة الملاسيزية في المختبر. (أ) M. sympodialis سلالة ATCC 42132 نمت لمدة 3 أيام عند 30 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة في وسط mDixon السائل (يسار) بجوار قارورة Erlenmeyer الضابطة التي تحتوي على وسط mDixon الذي لم يتم تلقيحه (يمين). (ب) مستعمرات M. sympodialis سلالة ATCC 42132 على أجار mDixon بعد 5 أيام من الحضانة عند 3...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات اجار سيجما ألدريتش A1296-1 كجم أتاني إيزوفلوران بيرامال للرعاية الصحية - خزانة Biosaftey (BSC) أسرع فائقة الأمان مجموعة داسيت 5594 معتمد من BSL2 الطرد المركزي إيبندورف 5415 د متوافق مع أنابيب Eppendorf 2 مل الثور الصفراء المجفف سيجما ألدريتش 70168-100 جرام أنابيب إيبندورف (2 مل) إيبندورف 0030 120.094 الجلوكوز سيجما ألدريتش 49159-5 كجم جيلسيرول (99٪) هانيويل 10314830 وسادة التدفئة إيكينماير 648048 حاضنة Hereaus B20 هيريوس 412047753 معتمد من BSL2 كيتاسول (100 مجم) Graeub AG 6680416 لوحة تسخين أرجوانية MR Hei-Standard أدوات هايدولف 442-1355 Malassezia spp. ATCC 14522 ، 14521 ، 42132 مستخلص الشعير سيجما ألدريتش 70167-500 جرام اضرب أنابيب المحيط الحيوي (200 ميكرولتر) سارستيدت إيه جي 7084211 قفل آمن زيت الزيتون الأصلي - - Commerc. متاح نونيديت P40 مختبر أكسون 1694,0250 Oditest قياس الابتكار كروبلين S0247 المدى 0-5 مم حمض الأوليك سيجما ألدريتش 75090-5 مل الببتون أوكسويد ل.ب0037 أطباق بتري سارستيدت إيه جي 82.1473 [إ] محلول ملح مخزن بالفوسفات (PBS ، 1x) أميميد / المفهوم الحيوي 3-05F39 رومبون (2 ٪) باير KP0BFHR حاضنة الاهتزاز Infors Minitron المعلومات - معتمد من BSL2 مطياف جينواي 20308 قياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر مطياف Cuvettes غرينر بيو ون 613101 كرات الفولاذ المقاوم للصدأ (5 مم) ABF كو 5G80 1.3541 محاقن 1 مل Sub-Q BD Bioscience 305501 الأنسجة لايزر II كوياجن 85300 Transpore الشريط هيبوالحساسية 3 م 1527-1 توين 40 سيجما ألدريتش P1504-100 مل فيتامين أ كريم العين ريتينولي بالميتاس باوش آند لومب Commerc. متاح