اختبار لدراسة دور الفيترونكتين في التصاق البكتيري بالخلايا الظهارية المضيفة

الملخص

المصدر: سينغ ، ب. وآخرون ، فحوصات لدراسة دور الفيترونكتين في التصاق البكتيري ومقاومة المصل. J. Vis. Exp. (2018)

في هذا الفيديو، نوضح اختبارا لدراسة دور الفيترونكتين في المستدمية النزلية الالتصاق بالخلايا الظهارية المضيفة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. دراسة التصاق البكتيريا المعتمدة على Vn بالخلايا الظهارية

1. زراعة الخلايا A549 (الخلايا الظهارية السنخية من النوع الثاني) في قارورة زراعة أنسجة^{مقاس 75 سم 2} مع وسط F12 مكمل بمصل ربلة الساق الجنينية بنسبة 10٪ (vol/vol) (FCS) (متوسط كامل) و 5 ميكروغرام / مل جنتاميسين. احتضان القارورة في حاضنة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ عند 37 درجة مئوية لمدة 3 أيام حتى تتماسك 80٪ (يمكن تقدير التقاء التقاء من خلال تصور التغطية السطحية بواسطة الخلايا باستخدام مجهر مقلوب). توضح الخطوات الأربع التالية كيفية تحضير الخلايا الظهارية للمقايس.
   1. اغسل طبقة واحدة من الخلية في القارورة مرتين باستخدام 20 مل من PBS عن طريق الدوران اللطيف. لفصل الخلايا عن سطح القارورة ، أضف 2 مل من محلول إنزيم انفصال الخلية واحتضان القارورة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. اضغط على القارورة براحة يدك لفصل جميع الخلايا عن السطح البلاستيكي. الماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات لتفريق كتل الخلايا.
   2. أضف 18 مل من الوسط الكامل F12 إلى القارورة وانقل معلق الخلية بالكامل إلى أنبوب فالكون معقم سعة 50 مل. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية لمدة 5 دقائق عند 200 × جم عند RT وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق حبيبات الخلية في 10 مل من الوسط الكامل F12.
   3. قم بإزالة 10 ميكرولتر من معلق الخلية وضعه في أنبوب Eppendorf ، ثم أضف 90 ميكرولتر من محلول Trypan الأزرق. قم بتحميل العينة في مقياس كثافة الدم (عمق 0.1 مم) بعد وضع الغطاء.
   4. احسب جميع الخلايا القابلة للحياة في المناطق A و B و C و D (يتكون كل حقل من 16 مربعا ، وتبلغ مساحة كل مربع 0.0025 مم²) ، ثم احسب متوسط عدد الخلايا ([A + B + C + D] / 4). احسب عدد الخلايا لكل مليلتر باستخدام المعادلة التالية:
      خلايا قابلة للحياة / مل = متوسط عدد الخلايا × 10⁴ × عامل التخفيف.
      ملاحظه: هنا ، عامل التخفيف هو 10.
   5. خفف معلق الخلية إلى 5.0 × 10³ خلايا / مل باستخدام وسط كامل يحتوي على 5 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين. قم بتوزيع 500 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر من لوحة زراعة الخلايا المكونة من 24 بئرا. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} حتى تتلاقى الخلايا بنسبة 90٪.
2. قبل الإصابة البكتيرية ، قم بإزالة الوسط من الآبار وأضف وسط F12 (بدون FCS) ، ثم احتضانه طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
3. اغسل الخلية أحادية الطبقة ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من PBS في RT. ضع اللوحة على الثلج وأضف 100 ميكرولتر من وسط F12 المبرد مسبقا الذي يحتوي على 10 ميكروغرام / مل من Vn. احتضان اللوحة عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة. لآبار التحكم ، أضف وسط F12 فقط.
4. بعد الحضانة ، تخلص من المحلول عن طريق سحب العينات واغسل طبقة الخلية مرتين باستخدام 1 مل من PBS في RT.
5. ثقافة Hif العزلات السريرية في وسط تسريب الدماغ والقلب (BHI) مكمل ب 10 ميكروغرام / مل NAD والهيمين عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة. استخدم وسط لوريا بيرتاني لزراعة الإشريكية القولونية. حصاد Hif في منتصف مرحلة لوغاريتم (OD600 = 0.3) وإعادة تعليق البكتيريا في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، درجة الحموضة 7.2 ، التي تحتوي على 1٪ (وزن / حجم) ألبومين مصل البقر (BSA) (مانع المخزن المؤقت ؛ PBS-BSA). اضبط التعليق على 10⁹ CFU / مل. أعد تعليق مزرعة Hif M10 المزروعة حديثا في وسط F12 (2×10⁸ CFU / مل). أضف 100 ميكرولتر من هذا المعلق البكتيري إلى كل بئر واحتضن اللوحة لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية < / > ملاحظه: يحتوي كل بئر على ما يقرب من 2 × 10⁵ خلايا A549. للعدوى, تمت إضافة 2 × 10⁷ CFU البكتيرية, ما يتوافق مع تعدد العدوى من 100.
6. قم بإزالة الوسط عن طريق سحب العينة واغسل الخلايا الظهارية A549 ثلاث مرات باستخدام PBS. أضف 50 ميكرولتر / بئر من محلول انفصال الخلية واحتضان اللوحة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
7. بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولتر من F12 الوسط الكامل لكل بئر لإيقاف التفاعل الأنزيمي. انقل الخلايا الظهارية (≈100 ميكرولتر [أي الحجم بأكمله]) من كل بئر إلى أنبوب زجاجي سعة 6 مل يحتوي على أربعة حبات زجاجية. قم بتحليل الخلايا في RT عن طريق الدوامة لمدة دقيقتين.
8. قم بتخفيف 10 ميكرولتر من محللة الخلية 100 مرة عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من المحللة إلى 990 ميكرولتر من وسط F12. طبق 10 ميكرولتر من العينة المخففة على طبق أجار الشوكولاتة.
9. احتضن طبق أجار الشوكولاتة عند 37 درجة مئوية طوال الليل ، ثم عد المستعمرات. كل مستعمرة تمثل CFU واحدا.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
5 مل من البوليسترين أنبوب دائري القاع	BD Falcon	60819-138	12 × 75 ملم نمط
5٪ CO2 حاضنة موردة	حراري علمي	BBD6220
6 مل أنبوب البوليسترين المستدير القاع	VWR	89000-478	12 × نمط 75 مم مع غطاء
أطباق 24 بئر	BD Falcon	08-772-1H	درجة زراعة الخلايا
75 سم2 قارورة زراعة الأنسجة	BD Falcon	BD353136	تنفيس
A549 خط الخلية البشري	سيجما ألدريتش	86012804-1VL
إنزيم انفصال الخلية (Accutase)	سيجما ألدريتش	A6964-500ML	درجة زراعة الخلية
ألبومينات مصل الأبقار (BSA)	سيجما ألدريتش	A2058	مناسب لزراعة الخلايا
F12 متوسط	سيجما ألدريتش	D6421	درجة ثقافة الخلية
مصل ربلة الساق الجنينية (FCS)	سيجما ألدريتش	12003C	مناسب لزراعة الخلايا
مقياس الدم	مارينفيلد	640210
قارورة زراعة الأنسجة	BD Falcon	3175167	75 سم2
فيترونكتين (Vn) من البلازما البشرية	سيجما ألدريتش	V8379-50UG	درجة زراعة الخلايا