نموذج لعدوى الغشاء المخاطي لعنق الرحم البشري لدراسة التسبب في فيروس نقص المناعة البشرية في حالات خارج الجسم الحي

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Introini، A.، et al.، عدوى Ex vivo للأنسجة اللمفاوية البشرية والغشاء المخاطي للأعضاء التناسلية الأنثوية بفيروس نقص المناعة البشرية 1 وزراعة النسيج. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو العدوى خارج الجسم الحي للأنسجة المخاطية للرحم البشري بفيروس نقص المناعة البشرية من النوع 1 ، فيروس نقص المناعة البشرية -1 ، وصيانتها فوق إسفنج الجيلاتين في واجهة الهواء السائل. تسمح هذه الطريقة بمراقبة تكاثر فيروس نقص المناعة البشرية -1 والتسبب في الأنسجة البشرية.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

< p class = "jove_title" >1. تشريح وعدوى الغشاء المخاطي لعنق الرحم

ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج ، يجب معالجة مستخلصات الغشاء المخاطي لعنق الرحم وإصابتها في أقرب وقت ممكن بعد الجراحة ، ويفضل أن يكون ذلك في نفس يوم الجراحة. بدلا من ذلك ، يمكن تخزين العينات مغمورة في CMT (وسائط الثقافة المكملة بالمضادات الحيوية) عند 4 درجات مئوية طوال الليل ، وتصاب مباشرة بعد التشريح.

1. امنح CM وقتا كافيا للوصول إلى RT أو ضعه في حمام مائي دافئ مسبقا عند 37 درجة مئوية. استكمل CM بمحلول المضادات الحيوية (CMT) قبل الاستخدام. تخلص من أي محلول مضاد حيوي متبقي. صب محلول الإيثانول بنسبة 70٪ في وعاء نظيف لامتصاص الملقط والمشرط عند الحاجة أثناء إجراء التشريح. نظف الأدوات وقم بتغيير شفرة المشرط بين تشريح العينات من متبرعين متعددين.
2. باستخدام ملقط معقم ، انقل العينة من حاوية النقل إلى طبق بتري مقاس 100 مم يحتوي على 10-20 مل من CMT.
3. استخدم غطاء طبق بتري كسطح تقطيع لتشريح الأنسجة. أمسك الأنسجة برفق باستخدام ملقط ، وافصل الغشاء المخاطي للشق و / أو باطن عنق الرحم عن الأنسجة اللحمية والعضلية السفلية (تحت الغشاء المخاطي) بمشرط وشفرة للحصول على شرائط من الغشاء المخاطي.
   ملاحظه: أثناء العمل على قطعة واحدة من الأنسجة ، من المهم إبقاء باقي الأنسجة مغمورة في وسط لتجنب جفاف الأنسجة.
4. قطع الغشاء المخاطي إلى شرائح بعرض 2 مم ، وقم بإزالة والتخلص من أكبر قدر ممكن من الغشاء المخاطي ، مع ترك طبقة من الأنسجة بسمك 2 مم فقط. قطع الشرائط إلى كتل بسمك 2 مم. يجب أن ينتج عن هذا استنخاذ الأنسجة حوالي 8 مم³.
   تحذير: يؤدي التعامل مع الأدوات الحادة لتشريح العينات البشرية إلى زيادة خطر الإصابة والتلوث. يجب على المشغل التفكير في ارتداء قفازات معدنية وشبكية ومقاومة للقطع كحماية إضافية.
5. انقل الأنسجة إلى طبق بتري جديد مقاس 100 مم يحتوي على 10-20 مل من CMT لتجنب جفاف الأنسجة أثناء المضي قدما في التشريح. في نهاية التشريح ، قم بتدوير اللوحة لتوزيع الزرع بشكل عشوائي.
6. باستخدام ملقط معقم ، انقل المكثفات إلى أنبوب (أنبوب) مخروطي معقم سعة 1.5 مل (بحد أقصى 16 مستحضرا لكل أنبوب). قم بإزالة أي وسيط في الأنبوب باستخدام ماصة.
7. قم بإذابة مستحضر فيروس نقص المناعة البشرية -1 في حمام مائي عند 37 درجة مئوية. إذا لزم الأمر ، قم بتخفيف مخزون الفيروس ب CM. انقل الفيروس إلى أنبوب (أنبوب) يحتوي على النباتات. تخلص من أي مستحضر فيروس متبقي.
   ملاحظه: يجب تخفيف مخزون الفيروس بحيث يتم احتواء اللقاح المختار بحجم لا يقل عن 0.5 مل (الجدول 1). لتقليل تباين النتائج بين التجارب المستقلة ، يجب استخدام نفس مستحضر الفيروس لدراسة كاملة (جدول المواد).
8. انقل الأنابيب إلى شاكر حراري واحتضانها لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية ، مع التأرجح عند 300 دورة في الدقيقة. اقلب الأنابيب برفق عدة مرات كل 30-60 دقيقة
   ملاحظة: من أجل العدوى الفعالة ، من الأهمية بمكان استخدام الحد الأدنى من الوقت المطلوب بين إذابة مستحضر فيروس نقص المناعة البشرية -1 ونقل الأنابيب إلى 37 درجة مئوية.
9. املأ صفيحة مكونة من 6 آبار ب 3-4 مل لكل بئر من محلول ملحي عازل للفوسفات المعقم (PBS). عند الحضانة مع فيروس نقص المناعة البشرية -1 ، تخلص من جميع مستحضرات الفيروس في الأنبوب (الأنبوب) في وعاء به محلول مطهر باستخدام ماصة. انقل النباتات المكثفة إلى صفيحة مكونة من 6 آبار تحتوي على PBS باستخدام الملقط.
10. اترك النباتات المسببة ترتاح في PBS لمدة دقيقة واحدة في RT ، ثم اغسلها عن طريق سحب PBS برفق لأعلى ولأسفل في البئر 2-3 مرات. تخلص من PBS في وعاء به محلول مطهر باستخدام ماصة. أضف 3-4 مل من PBS الجديد إلى كل بئر. كرر مرتين أخريين ليصبح المجموع ثلاث غسلات. تخلص من PBS قبل نقل النباتات إلى الإسفنج مباشرة لتجنب جفاف الأنسجة.
    ملاحظه: تطلق مستخلصات الغشاء المخاطي لعنق الرحم ، وخاصة باطن عنق الرحم ، كميات كبيرة من المخاط أثناء الإصابة. من الأهمية بمكان غسل وإزالة أكبر قدر ممكن من المخاط لأن الاحتفاظ غير المحدد بالنباتات الخارجية والإفراز اللاحق للفيروس في المادة الطافية المزروعة يمكن أن يخفي تكاثر الفيروس.
11. باستخدام الملقط ، انقل 5-8 نباتات فوق كل إسفنجة جيلاتين في طبق من 12 بئرا. أعد الطبق إلى الحاضنة.
12. التخلص من جميع النفايات البيولوجية في حاويات متقابلة وفقا للوائح المعهد بشأن التعامل مع المواد البيولوجية الخطرة وتقييم المخاطر المحددة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات جل فوم 12-7 مم إسفنجة جيلاتين قابلة للامتصاص شركه فايزر NDC: 0009-0315-08 يعمل الجلرغوم والإسفنجوستان بشكل جيد على قدم المساواة في الأنسجة النسيجية لكل من أنسجة اللوزتين وعنق الرحم. SPONGOSTAN Standard 70 × 50 × 10 مم إسفنجة جيلاتين مرقئ قابلة للامتصاص أجهزة فيروسان الطبية رقم MS0002 يعمل الجلرغوم والإسفنجوستان بشكل جيد على قدم المساواة في الأنسجة النسيجية لكل من أنسجة اللوزتين وعنق الرحم. RPMI 1640 مع الفينول الأحمر والجلوتامين ثيرموفيشر العلمي 21875034 RPMI1640 إضافة الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM ، وبيروفات الصوديوم ، والجنتاميسين ، والأمفوتريسين B ، و FBS 15٪ (حجم / حجم) لصنع وسط الاستزراع (CM). محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) درجة الحموضة 7.4 مع الكالسيوم والمغنيسيوم وأحمر الفينول لاستخدامها في تخزين ونقل العينات الجراحية. يمكن استبدال PBS بمحلول متساوي التوتر آخر بدرجة حموضة فسيولوجية. وسيط الثقافة هو الأفضل للتخزين طوال الليل. ماء معقم لزراعة الخلايا 70٪ محلول إيثانول محلول مطهر للتخلص من النفايات البيولوجية ملقط معدني معقم أو ملاقط مقص معدني معقم ملعقة معدنية معقمة مسطحة الوزن مشارط وشفرات معقمة 6 لوحات ثقافة الخلايا صحن بتري معقم ، 100 مم × 20 مم مستحضر فيروسي HIV-1 خال من الخلايا HIV-1BaL برنامج كاشف الإيدز للمعاهد الوطنية للصحة 510 ريال يجب نشر الفيروس لتوليد مخزون كبير بما يكفي لإجراء العديد من التجارب. تعليق فيروس Aliquote وتخزينه عند -80 درجة مئوية. تجنب التجميد والذوبان المتكرر. المستحضر الفيروسي HIV-1 الخالي من الخلايا HIV-1LAI.04 برنامج كاشف الإيدز للمعاهد الوطنية للصحة 2522 يجب نشر الفيروس لتوليد مخزون كبير بما يكفي لإجراء العديد من التجارب. تعليق فيروس Aliquote وتخزينه عند -80 درجة مئوية. تجنب التجميد والذوبان المتكرر. أنابيب غطاء لولبي معقمة 1.5 و 2 مل مجموعة حمام مائي على 37 درجة مئوية خزانة السلامة البيولوجية شاكر حمام جاف مع كتلة تسخين لأنابيب 1.5 مل ، ضبط عند 37 درجة مئوية ، 300 دورة في الدقيقة