$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
فئة
1. قياس النوع الأول IFN النشط بيولوجيا باستخدام خلايا مراسل HEK-Blue IFN-α / β.
< p class = "jove_content" >
ملاحظة: تم إنشاء هذه الخلايا عن طريق تعداء مستقر لخلايا HEK293 مع جينات STAT2 و IRF9 البشرية للحصول على مسار إشارات IFN من النوع الأول نشط بالكامل. كما أنها تحتوي على جين مراسل الفوسفاتيز القلوي المفرز (SEAP) تحت سيطرة مروج ISG54 المحفز IFN-α / β. يؤدي تحفيز هذه الخلايا باستخدام النوع الأول IFN إلى تنشيط مسار JAK / STAT / ISGF3 ويحفز إنتاج SEAP.
- الحفاظ على خلايا HEK-Blue IFN-α/β في DMEM المكملة بنسبة 10٪ FBS. قم بوضعها بكثافة 50.000 خلية لكل بئر في صفيحة مسطحة القاع مكونة من 96 بئرا ، بحجم نهائي يبلغ 180 ميكرولتر.
- امزج 220 ميكرولتر من PBMCs (مخففة عند 850.000 خلية / مل) أو 220 ميكرولتر من الخلايا المتغصنة البلازمية (pDCs) (بتركيز يتراوح من 100,000 إلى 500,000 خلية / مل) مع 30 ميكرولتر من الخلايا التائية المصابة (مخففة عند 106 خلايا / مل) لكل بئر في صفيحة بئر 96 قاع U.
- احتضان المزارع المشتركة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 18-22 ساعة ، ثم انقلها إلى صفيحة بئر 96 قاع V. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 400 × جم.
- أضف 20 ميكرولتر من المادة الطافية للزراعة المشتركة إلى كل بئر في نسختين. تتطلب كل لوحة أيضا مجموعة من أدوات التحكم القياسية الداخلية (IFNα البشري ، التركيز النهائي من 100 U / ml إلى 2,500 U / ml). احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 18-22 ساعة.
- تحديد مستويات نشاط الفوسفاتيز القلوي باستخدام محلول QUANTI-Blue ، والذي يتغير من اللون الوردي إلى الأرجواني / الأزرق في وجود الإنزيم. قم بإعداد QUANTI-Blue باتباع توصيات الشركة المصنعة. أضف 180 ميكرولتر من هذا المحلول إلى كل بئر من صفيحة مسطحة القاع 96 بئرا. أضف إلى كل بئر أيضا 20 ميكرولتر من الخلايا الطافية المستحثة HEK-Blue IFN-α / β واحتضان اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية حتى يتطور اللون في آبار التحكم القياسية IFN.
- قم بتقييم مستويات SEAP باستخدام مقياس الطيف الضوئي عند 620-655 نانومتر وحدد تركيز النوع الأول من IFN عن طريق الاستقراء من الجزء الخطي من منحنى IFN القياسي.