تقنية لتوليد جزيئات شبيهة بفيروس الأنفلونزا عبر نظام الثدييات

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Arevalo ، M. T. ، et al. التعبير عن الجسيمات الشبيهة بالفيروسات وتنقيتها للتطعيم. J. Vis. Exp. (2016).

يوضح هذا الفيديو توليد جزيئات شبيهة بفيروس الأنفلونزا (VLPs) في نظام الثدييات. عند التعبير عن ثلاثة نواقل تعبير حقيقية النواة - تشفير بروتينات هيكلية فيروسية مختلفة - في الخلايا المضيفة المناسبة للثدييات ، تتجمع البروتينات الفيروسية المعبر عنها ذاتيا في VLPs على غشاء البلازما المضيف وتنطلق عن طريق التبرعم من سطح الخلية.

البروتوكول

فئة

1. نظام التعبير عن الثدييات لتوليد الأنفلونزا H3N2 VLP

1. البروتينات السكرية الهيكلية الفيروسية شبه المستنسخة هيماجلوتينين (HA) ، والنورامينيداز (NA) ، وفيروس نقص المناعة البشرية (HIV) Gag (مستضد خاص بالمجموعة) p55 في نواقل التعبير حقيقية النواة ، مثل pTR600 الموصوف سابقا.
2. تضخيم الحمض النووي في الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا (على سبيل المثال ، DH5α) وعزل البلازميد من الدرجة الشفافة باستخدام مجموعة تنقية البلازميد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تعتمد كمية الحمض النووي على المحصول واحتياجات المستخدم.
3. الحفاظ على خط خلايا الثدييات ، 293T ، في وسط النمو الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ في حاضنة مرطبة.
4. قم بزراعة الخلايا بحيث تحتوي قارورة ثقافة الأنسجة T-150 على 45-75 × 10⁶ خلايا لكل قارورة بحيث تحصل القارورة على التصاق كامل للخلية و 85-95٪ من التقاء الخلايا بحلول اليوم التالي. افحص الخلايا تحت المجهر بحثا عن التقاء المطلوب.
   ملاحظه: يوصى عادة بكثافة الخلايا العالية للحصول على تعبير بروتين مثالي مع الحد الأدنى من السمية الخلوية عند استخدام كواشف التعدين التجارية ، ومع ذلك ، قد يؤدي الإفراط في التقاء إلى تراكم النفايات الخلوية والمنتجات الثانوية وتقليل قابلية الخلية للحياة.
5. في يوم التعدي ، قم بإعداد الجسيمات الشحمية وخليط الحمض النووي وفقا لتوصيات الشركة المصنعة وقم بتحويل خلايا الحمض النووي بتكوين DNA 1: 1: 2 من HA: NA: Gag بكمية إجمالية من الحمض النووي تبلغ 40 ميكروغرام لكل قارورة T-150. تمييع الحمض النووي ومحاليل الجسيمات الشحمية في وسط تعداء خالية من المصل بدون مضادات حيوية بحيث تحتوي كل قارورة على حجم إجمالي يتراوح من 20-30 مل.
   ملاحظه: قد تتطلب نسبة التركيبات الجينية تحسين المستخدم. على الرغم من عدم إثباته هنا ، فقد تم إجراء تعدي مماثل مع الفيروس المخلوي التنفسي (RSV) F و HIV Gag بنسبة 1: 1. بالنسبة لبلازميدات حمى الضمى (DENV) و CHIKV أحادية التعبير ، يتم استخدام ما مجموعه 20 ميكروغرام من الحمض النووي لكل قارورة T-150 للتعبير الأمثل. DNA: نسب كاشف الإرسال محسنة للمستخدم. استخدم وسط التعداء الموصى به بناء على طريقة التعدي ، أي أن تعداء الدهون المتعددة الكتل توصي بتقليل أو عدم وجود مصل الأبقار الجنينية وبالتالي يمكن استكمال الوسائط بهرمونات النمو والعناصر النزرة لدعم النمو في حالة عدم وجود المصل.
6. أعد القوارير إلى 37 درجة مئوية مع حاضنة 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂. للحصول على حجم 200 مل ، استخدم 9 قوارير T-150. يتم الاحتفاظ بالخلايا في وسط ثقافة تعداء حتى يوم حصاد VLP.
7. حصاد طافي مزرعة من الخلايا بعد 72-96 ساعة بعد التعدي اعتمادا على المستضد ، أو عندما تنخفض صلاحية الخلية إلى 70-80٪ ، كما هو مقدر بالفحص المجهري. انقل المادة الطافية إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مل وقم بتدوير الخلايا لأسفل عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية إلى الحطام الخلوي الحبيبي.
   ملاحظة: سيؤدي استبدال المادة الطافية لمدة 3 أيام بوسائط تعداء طازجة وخالية من المصل إلى الخلايا الملتصقة إلى مجموعة ثانية من VLPs ذات إنتاجية مماثلة أو منخفضة قليلا ويجب أن يحسنها المستخدم.
8. طاف المسبح وترشيحه من خلال غشاء مسام 0.22 ميكرومتر قبل الترسيب عن طريق الطرد المركزي الفائق.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات طقم البلازميد ماكسي كياجين هاتف 12163 DMEM سيلجرو 10-013 ليبوفيكتامين تقنيات الحياة L3000075 ليبوفيكتامين 2000 ، ليبوفيكتامين 3000 أوبتي-ميم I تقنيات الحياة 31985062 Cimarec I 6 لوحة نمام متعددة النقاط ثيرموفيشر العلمي 50094596 أنابيب الطرد المركزي الفائقة البوليكلير سيتون 7025 د.م 0.22 ميكرومتر أعلى مرشح فراغ (500 مل) نالجين 569-0020 الجلسرين سيغما جي 5516