$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. تعبير الجسيمات الشبيهة بفيروس الشيكونغونيا (VLP) باستخدام نظام خلايا فيروس الباكوفون / الحشرات
- توليد فيروس باكوجو مؤتلف يعبر عن قفيصة فيروس الشيكونغونيا وبروتينات الغلاف (C-E3-E2-6K-E1) من سلالة S-27 باستخدام نظام تعبير فيروس باكوفور التجاري.
- زراعة خلايا Spodoptera frugiperda Sf9 في وسط نمو Sf9 الخالي من المصل مع 100 وحدة / مل بنسلين و 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين عند 28 درجة مئوية. استخدم 3-5 × 105 ج / مل لبدء مزارع قارورة دوارة لنمو الخلايا المعلقة. المرور بشكل روتيني عندما تصل إلى كثافة الخلايا 2-4 × 106 ج / مل (كل 3-4 أيام).
- زراعة خلايا Sf9 في حالة تعليق في قوارير دوارة مع التقليب عند 130 دورة في الدقيقة على نظام لوحة النمام متعددة النقاط. للتهوية المناسبة ، حافظ على أحجام الثقافة بما لا يزيد عن نصف حجم القارورة الدوارة.
- للتعبير عن Chikungunya أو CHIK VLPs ، قم بإصابة خلايا Sf9 بكثافة 2 × 106 خلايا / مل بالفيروس العصبي المؤتلف عند تعدد العدوى 1 والعودة إلى حاضنة 28 درجة مئوية. عادة ، تصيب واحدة أو اثنتين من قوارير الدوار ، تحتوي على 250 مل من خلايا Sf9.
ملاحظه: على الرغم من أننا لا نستخدم هذه الطريقة ، إلا أنه يمكن زراعة خلايا Sf9 في قوارير شاكر عند 28 درجة مئوية باستخدام منصة شاكر.
- حصاد المزارع بعد 72-96 ساعة بعد الإصابة ، أو عندما تنخفض صلاحية الخلية إلى 70-80٪ على النحو الذي يحدده Trypan Blue Exclusion وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
ملاحظه: تستمر الخلايا في التكاثر أثناء الإصابة وهناك صلاحية ~ 80٪ في مزارع Sf9 المصابة بالفيروس العصاري المؤتلف CHIK VLP في 3 أيام بعد الإصابة (dpi). الخلايا المصابة بفيروس باكوجو أكبر في المظهر. قد يتغير التشكل أيضا من دائري إلى مستطيل. في المراحل المتأخرة من عدوى فيروس باكوفلو ، بدأت الخلايا في التحلل.
- انقل الثقافات مباشرة من ثقافة التعليق إلى أنابيب مخروطية سعة 50 مل وقم بتدوير الخلايا لأسفل عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- اجمع المواد الطافية وقم بالتصفية من خلال غشاء مسام 0.22 ميكرومتر قبل الترسيب عن طريق الطرد المركزي الفائق.