الفحص المجهري داخل الحيوية لتحليل التفاعلات بين خلايا الدم والبطانة في نموذج فأر التهابي

الملخص

المصدر: Herr، N. et al.، الفحص المجهري داخل الحيوية لتفاعلات الكريات البيض والبطانية والصفائح الدموية في الأوردة المساريقية في الفئران. (2015)

في هذا الفيديو ، نوضح التصور في الوقت الفعلي لتفاعلات خلايا الدم البطانية في الأوردة المساريقية لنموذج فأر يتم حقنه داخل الصفاق بعديدات السكاريد الدهنية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< ص الفئة = "jove_title" >1. التعامل مع وإعدادها وتحريضها

1. استخدم الفئران الذكور التي تتراوح أعمارها بين 4 و 6 أسابيع ويتراوح وزنها بين 16 و 20 جم. ملاحظة: إذا كانت الفئران أكبر سنا أو أثقل ، فإنها تحتوي على دهون زائدة تحيط بالوعاء الدموي ، مما يحد من الملاحظة المجهرية.
2. تعقيم جميع الأدوات وطاولة المجهر قبل الجراحة.
3. حقن 20 ملغم / كجم LPS (عديدات السكاريد الدهنية) داخل الصفاق قبل 4 ساعات من الفحص المجهري في الفأر الحي للحث على التهاب بكتيري.
4. قم بتسخين محلول ملحي بنسبة 0.9٪ في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لترطيب الغرفة البلاستيكية وأنسجة المساريق.
5. تخدير الفأر بحقن داخل الصفاق من الكيتامين (100 مجم / كغ) والزيلازين (5 مجم / كغ) قبل إجراء الفحص المجهري مباشرة. يمكن استخدام التخدير البديل ، على سبيل المثال ، استنشاق 2٪ من الأيزوفلوران. تأكد من التخدير المناسب عن طريق فقدان الاستجابة للتحفيز الانعكاسي (قرصة إصبع القدم أو الذيل بضغط قوي).
6. قم بإزالة البطن باستخدام ماكينة حلاقة وإزالة الشعر المتساقط بشاش مشبع بالإيثانول 70٪.
7. ضع مرهما بيطري على عيني الفأر لمنع الجفاف أثناء التخدير.

< p class = "jove_title" >2. الجراحة

1. تعقيم البطن باستخدام 70٪ إيثانول. هذه الطريقة ليست طريقة معقمة ويمكن أن تكون قاتلة في نهاية التجربة.
2. إجراء شق البطن المتوسط: افتح جلد البطن باستخدام ملقط صغير منحني ومقص صغير. تحديد الأوعية الشرسوفية وفتح الصفاق في منطقة الخط ألبا, لحماية الأوعية.
3. ضع بضع قطرات من المحلول الملحي المسخن مسبقا في تجويف البطن للحفاظ على رطوبة الأنسجة.
4. قم بتسمية الكريات البيض والصفائح الدموية بشكل فلوري عن طريق حقن 50 ميكرولتر من الرودامين 6G (1 مجم / مل) بشكل رجعي المداري.
5. قم بإخراج حلقة من الدقاق من الخارج وضعها في طبق بتري بقطر 10 سم ؛ تأكد من الحفاظ على رطوبة الأنسجة عن طريق تطبيق محلول ملحي مسخن مسبقا 37 درجة مئوية (0.9٪) كل دقيقتين.

< p class = "jove_title" >3. الفحص المجهري داخل الحيوية

1. ضع الماوس تحت المجهر وأحضر الوريد المساريق بقطر 200-300 ميكرومتر في وسط الرؤية. اختر وعاءا بدون محيط دهني مرئي.
2. لا تلمس أوعية المساريق وبالتالي تجنب تحفيز البطانة. تعامل مع حلقة الدقاق بحذر.
3. تصور تفاعلات خلايا الدم البطانية باستخدام مجهر مقلوب أو مستقيم وكاميرا باستخدام برنامج المجهر. سجل تفاعلات خلايا الدم البطانية لمدة 1 دقيقة في 4 عروق مختلفة لكل فأر.
4. القتل الرحيم للفأر عن طريق خلع عنق الرحم بعد الانتهاء من تجارب التصوير.

< p class = "jove_title" >4. التحليل

1. قم بإجراء التحليل في وضع عدم الاتصال وأعمى لجميع المعلمات. إجراء التحليل باستخدام أي برنامج مناسب.
2. تأكد من ظروف تدفق الدم المستقرة والقابلة للمقارنة بين الأفراد في مقاطع سينمائية عالية الدقة زمنيا (معدل الإطارات الأقصى) تركز على تدفق خلايا الدم داخل اللمع.
3. تحديد عدد الكريات البيض المتدحرجة. لذلك ارسم خطا عموديا عبر الوريد واحسب جميع الكريات البيض التي تعبر هذا الخط في 1 دقيقة.
4. حدد سرعة التدحرج عن طريق قياس الوقت الذي تحتاجه كريات الدم البيضاء الواحدة لاجتياز مسافة 50 ميكرومتر أثناء التدحرج بثبات على البطانة. للقيام بذلك ، ارسم خطين رأسيين على مسافة 50 ميكرومتر عبر الوريد.
   1. قم بقياس الوقت الذي يحتاجه الكريات البيض التمثيلية للانتقال من سطر إلى آخر. احسب سرعة الكريات البيض بقسمة 50 ميكرومتر على الوقت المطلوب (ميكرومتر / ثانية).
5. قياس التصاق الكريات البيض في مجال 0.04 مم². للقيام بذلك ، ارسم مربعا بطول ضلع 200 ميكرومتر في الوريد.
   1. عد الكريات البيض الملتصقة الثابتة، والتي تعرف بأنها لا توجد حركة مرئية لمدة 30 ثانية، داخل هذا المربع.
6. احسب عدد الصفائح الدموية المرتبطة بكريات البيض الواحدة لتحديد تفاعلات الصفائح الدموية والكريات البيض.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الرودامين 6 جرام سيجما ألدريتش 989-38-8 عديدات السكاريد الدهنية من الإشريكية القولونية 055: B5 سيجما ألدريتش L2637