الحقن تحت الجلد للمستضد البكتيري للحث على التهاب جهازي في نموذج الفئران

الملخص

المصدر: John ، S. et al. ، التهاب القزحية الفطري (PMU) كنموذج لالتهاب القزحية التالي للعدوى.J. Vis. Exp. (2021)

يوضح هذا الفيديو تحريض الالتهاب الجهازي في فأر مخدر. يؤدي حقن مستودعات المستضد المساعد للبكتيريا الفطرية إلى إطلاق السيتوكين والالتهاب الموضعي. تفتح الأوعية اللمفاوية ، مما يتيح دخول الخلايا المناعية إلى الغدد الليمفاوية وتنشيط الخلايا التائية ، التي تطلق السيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، مما يؤدي إلى التهاب واسع النطاق.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحضير المستضد للحقن تحت الجلد

1. قم بتنفيذ جميع الإجراءات في هذا القسم داخل غطاء الدخان الكيميائي لمنع الاستنشاق أو ملامسة الجلد لمتفطرة السل ، مسحوق Mtb H37Ra. تعامل وفقا لسياساتك المؤسسية لمساعد فرويند الكامل (عادة BSL-1). يتضمن ذلك استخدام القفازات المقاومة للمواد الكيميائية ونظارات السلامة وملابس العمل الواقية (معطف المختبر).
2. استخدم تقنية معقمة جيدة لمنع تلوث الكواشف التي سيتم إدخالها في التجارب.
3. اصنع معلق Mtb في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) عن طريق خلط 5 مجم من مسحوق المتفطرة السلية H37Ra المجفف بالتجميد والمقتل بالحرارة مع 2.5 مل من PBS البارد في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 5 مل. دوامة مرة واحدة لمدة 30 ثانية ثم ضعها على الجليد.
4. لتوليد تعليق دقيق ل H37Ra في PBS ، قم بصوتنة التعليق على الجليد لمدة 5 دقائق.
   1. قم بفك جسم وحدة المحول وتنظيف المسبار بمسحة كحول بنسبة 70٪ (v / v).
   2. قم بتشغيل الصوتنة ، واضبط إعداد الطاقة على 4 عن طريق تدوير مقبض التحكم في الطاقة ، واغمر طرف المسبار في مسحوق البكتيريا الفطرية المحتوي على PBS. تأكد من أن طرف المسبار مغمور حتى نصف عمق العينة على الأقل وأن طرف المسبار لا يلامس جدار أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
5. قم بتقطيع الخليط على الثلج لمدة 30 ثانية ، وتوقف مؤقتا لمدة 30 ثانية ، وكرر ذلك لمدة 5 دقائق لتفريق المسحوق بالكامل في تعليق متساو دون تسخين السائل.
6. أضف 2.5 مل من مساعد فرويند غير المكتمل إلى الخليط وكرر عملية الصوتنة على الثلج حتى يشكل المستحلب قواما يشبه معجون الأسنان.
7. اضبط الطاقة على 0 باستخدام مقبض التحكم وقم بإيقاف تشغيل الوحدة لإنهاء الصوتنة. قم بإزالة الطرف من التعليق وامسح المسبار بقطعة كحول.
8. قم بتخزين مستحلب المستضد عند 4 درجات مئوية. سيساعد عمل دفعات من المستحلب على ضمان الاتساق عبر التجارب. يمكن تخزين المستحلب عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.

< ص الفئة = "jove_title" >2. الحقن تحت الجلد

1. إجراء الحقن تحت الجلد قبل أسبوع من الحقن داخل الجسم الزجاجي (المحدد باليوم -7).
2. قم بتحميل حقنة سعة 1 مل (بدون إبرة متصلة) بمستحلب البكتيريا الفطرية. نظرا لزوجة وتعتيم المستحلب ، يمكن لفقاعات الهواء التي يصعب رؤيتها أن تملأ المحقنة.
   1. لمنع فقاعات الهواء في المحقنة ، بعد تحميل 0.2-0.3 مل من المستحلب ، اقلب المحقنة (الطرف متجها لأعلى) واضغط برفق على المحقنة بشكل متكرر على حافة المنضدة لإحضار الفقاعات إلى السطح.
3. طرد الهواء من المحقنة واستمر في ملء المحقنة. اقلب واضغط بشكل متقطع حتى تمتلئ.
4. ضع إبرة 25 جم على المحقنة وقم بتقديم المستحلب لملء الإبرة. قم بتخزين المحقنة على الثلج حتى تستخدم.
5. لإجراء الحقن تحت الجلد بأمان ، قم إما بتخدير الفأر أو استخدم طرق ضبط النفس الإنسانية التي تسمح بسهولة الوصول إلى مؤخرة.
6. للتخدير للحقن تحت الجلد ، ضع في غرفة تحريض الأيزوفلوران (3٪ -4٪ للحث و 1٪ -3٪ للصيانة). بمجرد التخدير ، تأكد من أن الفأر لديه معدل تنفس بطيء ولا تظهر عليه أي علامات على ضيق التنفس.
7. ضع الحقن تحت الجلد إما على السطح الظهري للوركين أو على السطح البطني للساقين القريبة من منطقة الغدد الليمفاوية الأربية.
   1. أدخل الإبرة بعناية لمنع الحقن في العضلات. حقن 0.05 مل من مستحلب Mtb في الفضاء تحت الجلد. لا تقم بإزالة الإبرة على الفور للسماح بحقن المستحلب السميك بالكامل.
   2. كرر الحقن على الجانبين الأيسر والأيمن ليصبح المجموع 0.1 مل لكل.
8. إذا تم تخديره ، ضع الماوس على وسادة تسخين دافئة حتى الشفاء التام. لا تترك الفأر دون رقابة حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي.
9. أعد الماوس إلى قفصه عند الشفاء التام وقم بتسمية بطاقة القفص بتاريخ الحقن تحت الجلد.
10. توفير التسكين مع الأسيتامينوفين الفموي (200 ملغم/كغ/يوم)، ولكن ليس العقاقير غير الستيرويدية المضادة للالتهابات (NSAIDs) لأن العوامل المضادة للالتهابات يمكن أن تؤثر على تحريض التهاب القزحية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مساعد فرويند غير المكتمل BD Difco ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية هاتف: 263910 H37Ra مستخلص البكتيريا الفطرية المجففة بالتجميد BD Difco ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية 231141 إبرة الأنسولين Exel International ، الولايات المتحدة الأمريكية هاتف: 26029 1 مل إيزوفلوران برنامج تلفزيوني جيبكو 14190 رينجيت ماليزي 2255 لايكا بيوأنظمة ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية تقطيع الأنسجة حقنة السل بيكتون ، ديكنسون وشركاه ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية 309602 1 مل تايلينول شركة جونسون آند جونسون للمستهلكين ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية NDC 50580-614-01 اسيتامينوفين