$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. تحضير المستضد للحقن تحت الجلد
- قم بتنفيذ جميع الإجراءات في هذا القسم داخل غطاء الدخان الكيميائي لمنع الاستنشاق أو ملامسة الجلد لمسحوق المتفطرة السلية (Mtb) H37Ra. تعامل وفقا لسياساتك المؤسسية لمساعد فرويند الكامل (عادة BSL-1). يتضمن ذلك استخدام القفازات المقاومة للمواد الكيميائية ونظارات السلامة وملابس العمل الواقية (معطف المختبر).
- استخدم تقنية معقمة جيدة لمنع تلوث الكواشف التي سيتم إدخالها في التجارب.
- اصنع معلق Mtb في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) عن طريق خلط 5 مجم من مسحوق Mtb H37Ra المجفف بالتجميد والمقتول بالحرارة مع 2.5 مل من PBS البارد في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 5 مل. دوامة مرة واحدة لمدة 30 ثانية ثم ضعها على الجليد.
- لتوليد تعليق دقيق ل H37Ra في PBS ، قم بصوتنة التعليق على الجليد لمدة 5 دقائق.
- قم بفك جسم وحدة المحول وتنظيف المسبار بمسحة كحول بنسبة 70٪ (v / v).
- قم بتشغيل الصوتنة ، واضبط إعداد الطاقة على 4 عن طريق تدوير مقبض التحكم في الطاقة ، واغمر طرف المسبار في مسحوق البكتيريا الفطرية المحتوي على PBS. تأكد من أن طرف المسبار مغمور حتى نصف عمق العينة على الأقل وأن طرف المسبار لا يلامس جدار أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
- قم بتقطيع الخليط على الثلج لمدة 30 ثانية ، وتوقف مؤقتا لمدة 30 ثانية ، وكرر ذلك لمدة 5 دقائق لتفريق المسحوق بالكامل في تعليق متساو دون تسخين السائل.
- أضف 2.5 مل من مساعد فرويند غير المكتمل إلى الخليط وكرر عملية الصوتنة على الثلج حتى يشكل المستحلب قواما يشبه معجون الأسنان.
- اضبط الطاقة على 0 باستخدام مقبض التحكم وقم بإيقاف تشغيل الوحدة لإنهاء الصوتنة. قم بإزالة الطرف من التعليق وامسح المسبار بقطعة كحول.
- قم بتخزين مستحلب المستضد عند 4 درجات مئوية. سيساعد عمل دفعات من المستحلب على ضمان الاتساق عبر التجارب. يمكن تخزين المستحلب عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
< ص الفئة = "jove_title" >
2. الحقن تحت الجلد
- إجراء الحقن تحت الجلد قبل أسبوع من الحقن داخل الجسم الزجاجي (IVT) (المحدد على أنه اليوم -7).
- قم بتحميل حقنة سعة 1 مل (بدون إبرة متصلة) بمستحلب البكتيريا الفطرية. نظرا لزوجة وتعتيم المستحلب ، يمكن لفقاعات الهواء التي يصعب رؤيتها أن تملأ المحقنة.
- لمنع فقاعات الهواء في المحقنة ، بعد تحميل 0.2-0.3 مل من المستحلب ، اقلب المحقنة (الطرف متجها لأعلى) واضغط برفق على المحقنة بشكل متكرر على حافة المنضدة لإحضار الفقاعات إلى السطح.
- طرد الهواء من المحقنة واستمر في ملء المحقنة. اقلب واضغط بشكل متقطع حتى تمتلئ.
- ضع إبرة 25 جم على المحقنة وقم بتقديم المستحلب لملء الإبرة. قم بتخزين المحقنة على الثلج حتى تستخدم.
- لإجراء الحقن تحت الجلد بأمان ، قم إما بتخدير الفأر أو استخدم طرق ضبط النفس الإنسانية التي تسمح بسهولة الوصول إلى مؤخرة.
- للتخدير للحقن تحت الجلد ، ضع في غرفة تحريض الأيزوفلوران (3٪ -4٪ للحث و 1٪ -3٪ للصيانة). بمجرد التخدير ، تأكد من أن الفأر لديه معدل تنفس بطيء ولا تظهر عليه أي علامات على ضيق التنفس.
- ضع الحقن تحت الجلد إما على السطح الظهري للوركين أو على السطح البطني للساقين القريبة من منطقة الغدد الليمفاوية الأربية.
- أدخل الإبرة بعناية لمنع الحقن في العضلات. حقن 0.05 مل من مستحلب Mtb في الفضاء تحت الجلد. لا تقم بإزالة الإبرة على الفور للسماح بحقن المستحلب السميك بالكامل.
- كرر الحقن على الجانبين الأيسر والأيمن ليصبح المجموع 0.1 مل لكل.
- إذا تم تخديره ، ضع الماوس على وسادة تسخين دافئة حتى الشفاء التام. لا تترك الفأر دون رقابة حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي.
- أعد الماوس إلى قفصه عند الشفاء التام وقم بتسمية بطاقة القفص بتاريخ الحقن تحت الجلد.
- توفير التسكين مع الأسيتامينوفين الفموي (200 ملغ/كغ/يوم)، ولكن ليس العقاقير غير الستيرويدية المضادة للالتهابات (NSAIDs) لأن العوامل المضادة للالتهابات يمكن أن تؤثر على تحريض التهاب القزحية.
فئة
3. تحضير مخزون المستضد للحقن داخل الجسم الزجاجي
- قم بتنفيذ جميع الإجراءات الواردة في هذا القسم في ظل ظروف معقمة مناسبة لمنع تلوث معلق Mtb داخل الجسم الزجاجي.
- اصنع المعلقات داخل الجسم الزجاجي.
- لتحريض التهاب القنية الخفيف إلى المتوسط ، قم بعمل التعليق داخل الجسم الزجاجي بتركيز 5 مجم / مل عن طريق إضافة 5 مجم من مستخلص البكتيريا الفطرية إلى 1 مل من 1x PBS.
- لتحريض التهاب التطعيمات البادوية المعتدل إلى الشديد ، قم بعمل المعلق داخل الجسم الزجاجي بتركيز 10 مجم / مل عن طريق إضافة 10 مجم من مستخلص البكتيريا الفطرية إلى 1 مل من 1x PBS.
- دوامة مرة واحدة لمدة 30 ثانية ثم ضعها على الجليد.
- لتوليد تعليق دقيق من H37Ra في PBS ، صوتنة التعليق على الجليد لمدة 10 دقائق كما هو موضح في الخطوة 1.4. قم بتخزين محلول المخزون هذا بأحجام 100 ميكرولتر وتخزينه عند -20 درجة مئوية.
- قبل الاستخدام ، قم بإذابة الثلج في درجة حرارة الغرفة والدوامة على ارتفاع لمدة 1 دقيقة. احتفظ بالحقول على الجليد أثناء نقلها إلى منشأة.
< p class = "jove_title" >
4. إجراء الحقن داخل الجسم الزجاجي في اليوم 0
- تحضير
- ارتد قفازات فحص مجهزة ، وضع الماوس على ميزان الوزن للحصول على وزنه بالجرام.
- إعطاء حقنة داخل الصفاق بمقدار 0.02 مل / غرام من وزن الجسم من محلول يحتوي على 100 مجم / مل كيتامين و 20 مجم / مل زيلازين ممزوج بالماء المعقم لتخدير. يتضمن النهج البديل الحث باستخدام ~ 1.5٪ إيزوفلوران (مستنشق).
- انتظر حوالي دقيقتين حتى ينام الماوس ، ثم ضع الماوس في صندوق تسخين وقم بتغطية الغطاء. قم بإجراء اختبارات منعكس الألم مثل قرصة الأذن وأصابع القدم والذيل لتقييم عمق التخدير للإجراء.
- بمجرد النوم ، قم بتخدير القرنية بقطرة واحدة من 0.5٪ (v / v) tetracaine. تجنب الحصول على التتراكايين بالقرب من أنف الفأر أو فمه. بعد 10 ثوان ، امسح السائل الزائد.
ملاحظه: لقد لوحظ أن توسيع قزحية العين وتصور الغرفة الأمامية (AC) يتحسن عند إعطاء التخدير الموضعي ، ربما بسبب تحسين قمع منعكس القرنية مع التخدير الجهازي والموضعي المشترك. ومع ذلك ، يمكن حذف هذه الخطوة إذا رغبت في ذلك.
- توسيع التلميذ مع 1 قطرة من 2.5٪ (حجم / حجم) فينيلي إيفرين. توخي الحذر لتجنب أي قطرات زائدة قد تدخل الأنف أو الفم. بعد 2-3 دقائق ، تخلص من السائل الزائد.
- لتقليل خطر الإصابة بالتهاب باطن المقلة ، أضف قطرة واحدة من 5٪ من البيتادين إلى سطح العين والشعر المحيط. اتركيه على العين لمدة 2-3 دقائق < / >
ملاحظه: قم بإجراء جميع الإجراءات في هذا القسم في ظل ظروف معقمة مناسبة للوقاية من التهاب باطن المقلة.
- قم بإزالة البيتادين وتغطية العين بالهيبروميلوز (0.3٪) أو جل العين الكربومير 0.2٪ وزن / وزن) لمنع الجفاف تحت التخدير. سيساعد هذا أيضا في منع تكوين إعتام عدسة العين.
- إعداد نظام الحقن المجهري
- قم بإجراء الحقن داخل الجسم الزجاجي باستخدام مضخة دقيقة متصلة بوحدة تحكم في مضخة الحقنة الدقيقة وحقنة حقن (الشكل 1A-C). بدلا من ذلك ، قم بالحقن بإبرة 33 G متصلة بحقنة هاميلتون كما هو موضح في القسم الفرعي 4.4.
- قم بتوصيل إبرة 34 جم بحامل الحقن لتجميع الحاقن. قم بفك الغطاء اللولبي الفضي في الطرف الأمامي لحامل الحقن وحرك الإبرة في جسم الحامل في منتصف الطريق تقريبا. شد إصبع غطاء المسمار الفضي بإحكام.
- قم بتوصيل الأنبوب بحامل الحقن كما هو مذكور في الخطوات 4.2.4-4.2.5.
- لإدخال الأنبوب على حامل الحقن ، قم بفك المسمار البلاستيكي الموجود في الطرف الخلفي للحامل ، وحرك الأنبوب عبر الحشية بالداخل ، وشد المسمار.
- حافظ على فجوة طفيفة في نهاية الأنبوب لمنع تلف الأنابيب أثناء الحقن. راجع الشكل 1 ج.
- قم بإذابة 100 ميكرولتر من معلق مخزون المتفطرة.
- أضف 3 ميكرولتر من محلول الفلورسين الصوديوم 1٪ (AK-Fluor) ودوامة جيدا.
- قم بتحميل حقنة سعة 10 ميكرولتر بمزيج المستضد والفلورسين دون تضمين أي فقاعات هواء.
- قم بإزالة إبرة التحميل من المحقنة ، وحرك الأنبوب من خلال حشية الغطاء اللولبي الفضي حتى يصل الطرف إلى علامة الصفر في جسم المحقنة.
- بمجرد محاذاة طرف الأنبوب بشكل صحيح مع الموضع المطلوب ، شد إصبع الغطاء اللولبي بإحكام.
- اغسل المحلول في المحقنة من خلال أنبوب الحقن لتحميل النظام بالكامل. ثم كرر الخطوات 4.2.8-4.2.11 لإعادة تحميل المحقنة للحقن.
- لتثبيت المحقنة المحملة على المضخة الصغيرة ، اضغط على زر تحرير المشبك في نهاية المضخة الصغيرة لفتح مشابك المحقنة.
- ضع غطاء المكبس في حامل غطاء المكبس في الطرف الخلفي من المضخة الدقيقة.
- ثم حرك طوق المحقنة على سد الياقة وجسم المحقنة في مشبك المحقنة.
- حرر زر المشبك وشد برغي تثبيت المكبس. راجع الشكل 1 د.
- حرك حامل الحقن والإبرة من خلال المشبك o على جهاز الحقن التجسيمي. هذه منصة مخصصة. بدلا من ذلك ، يمكن حمل المحقنة ووضعها يدويا.
- اضبط حجم التسريب ومعدل حجم التسريب على وحدة التحكم في مضخة الحقنة الدقيقة لحقن 500 نانولتر لكل دورة بمعدل 40 نانولتر / ثانية ، على التوالي.
ملاحظه: يمكن استخدام معدلات حقن أسرع ، ومع ذلك ، قد يحدث المزيد من الارتجاع قبل تحقيق إعادة وضع الإبرة.
- اختبر النظام لضمان الأداء الصحيح قبل إجراء الحقن داخل الجسم الزجاجي.
ملاحظه: عندما يعمل نظام الحقن بشكل صحيح ، فإن تنشيط دورة الحقن باستخدام دواسة القدم أو وسادة التحكم سينتج عنه حركة مرئية لحامل غطاء المكبس وستظهر قطرة صغيرة من السائل المخضر عند طرف الإبرة. في حالة عدم إنتاج سائل ، قم بتنشيط دورات إضافية أو شطف المحقنة وإعادة تحميلها.
- قبل حقن العين ، امسح الإبرة برفق بقطعة إيثانول بنسبة 95٪.
- إجراء الحقن داخل الجسم الزجاجي
- يتم وضع الماوس على جهاز تجسيمي لإجراء الحقن.
- حافظ على دفء المسرح / المنصة التي يرتكز عليها الماوس عن طريق إرفاق 2-3 مناشف ورقية على سطحه.
- ضع الماوس في وضع الانبطاح على المنصة. استخدم قضبان الأذن اليمنى واليسرى لإصلاح رأس برفق. راجع الشكل 1 ه.
- ضع الماوس ووجهه تحت المنظار بحيث يكون الجانب الأنفي العلوي للعين اليمنى مرئيا.
- استخدم إبرة 30 جم لإزاحة الرموش وفضح الصلبة. تصور ليفي الوساق والأوعية الدموية الكعبرية.
- استخدم إبرة معقمة 30 جم لعمل ثقب توجيه في الصلبة 1-2 مم خلف الطرف.
- أدخل الإبرة 34 جم المرفقة بحامل الحقن في العين من خلال فتحة التوجيه بزاوية تتجنب العدسة ، ولكن ضع طرف الإبرة في التجويف الزجاجي.
- باستخدام وحدة التحكم في مضخة الحقنة الدقيقة ، قم بحقن 1 ميكرولتر من مستخلص Mtb بعناية في التجويف الزجاجي. في حالة الارتجاع المستمر ، قم بزيادة حجم الحقن إلى 1.5 ميكرولتر لضمان توصيل الجرعة الكافية.
ملاحظه: للضوابط الزائفة ، قم بحقن 1 ميكرولتر من PBS في عين.
- تحقق من وضع الجسم الزجاجي عن طريق تصور منعكس أخضر في العين. راجع الشكل 1F.
- بعد 10 ثوان ، اسحب الإبرة من العين. لاحظ أي ارتجاع.
- قم بإزالة الماوس من المنصة ، ضع 0.3٪ هيبروميلوز أو 0.2٪ وزن / وزن مرهم العين على كلتا العينين لحماية القرنية ، وانتقل إلى صندوق تسخين الاسترداد.
- لا تترك الفأر دون رقابة حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي. لا تعود إلى صحبة الأخرى حتى تتعافى تماما.
- عندما يكون الفأر مستيقظا تماما ، عد إلى القفص وأضف زجاجة ماء طبية من الأسيتامينوفين (200-300 مجم / كجم / يوم). قم بتسمية بطاقة القفص بتاريخ حقن IVT.
- الحقن داخل الجسم الزجاجي جيد التحمل بشكل عام. تشمل العلامات السريرية التي قد تشير إلى الألم والحاجة إلى إزالتها من الدراسة ثعلبة حول العين (التي تشير إلى صدمة ذاتية) ، وتقرح القرنية ، وفقدان الوزن ، والوضعية المنحنية.
