مقالة منهجية

تحضير وقياس لقاح المتفطرة بوفيس BCG lux للعدوى

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Asai ، M. et al. ، استخدام اللافقاريات غاليريا ميلونيلا كنموذج عدوى لدراسة مركب المتفطرة السلية. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو تحضير وقياس لقاح المتفطرة بوفيس Bacillus Calmette-Guérin lux باستخدام مقايسة التلألؤ البيولوجي وتعداد الوحدات المكونة للمستعمرة. يمكن استخدام اللقاح المحضر لدراسات العدوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الأعمال الموضحة أدناه في مختبر CL2 داخل خزانة السلامة الميكروبيولوجية من الفئة 2 (MSC) وفقا لإرشادات الصحة والسلامة المحلية.

< p class = "jove_title" >1. تحضير M. bovis BCG lux للعدوى

  1. قم بإذابة مخزون الجلسرين المجمد سعة 1.2 مل (15٪) من M. bovis BCG lux ، سلالة لقاح مونتريال التي تحولت مع البلازميد المكوكي pSMT1 الذي يحمل جينات luxAB من Vibrio harveyi التي تشفر إنزيم لوسيفيراز.
  2. تلقيح 15 مل من مرق ميدلبروك 7H9 الذي يحتوي على 0.2٪ جلسرين ، و 10٪ ألبومين ، وسكر العنب ، وتخصيب الكاتلاز (ADC) ، و 50 ميكروغرام / مل hygromycin مع 1.2 مل من BCG lux ، في قارورة Erlenmeyer تحمل علامة 250 مل.
  3. ضع القارورة في حاوية محكمة الغلق للسلامة الحيوية واحتضانها عند 37 درجة مئوية في حاضنة شاكر مدارية عند 220 دورة في الدقيقة لمدة 72 ساعة (أو حتى تصل المزرعة إلى مرحلة منتصف السجل من النمو).
  4. تحقق من نمو ثقافة BCG lux عن طريق تحضير تخفيفات 1:10 للثقافة في أنابيب مقياس الإضاءة باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ، درجة الحموضة 7.4 ، 0.01 M عازلة الفوسفات ، 0.0027 M كلوريد البوتاسيوم ، 0.137 M كلوريد الصوديوم) في نسختين. دوامة ، وتحميل أنابيب مقياس الإضاءة في مقياس الإضاءة وقياس التلألؤ البيولوجي (وحدة الضوء النسبي [RLU] / مل) باستخدام n-decyl aldehyde كركيزة (1٪ v / v في الإيثانول المطلق).
    ملاحظه: تم تحديد نسبة وحدات تشكيل RLU / مستعمرة (CFU) سابقا لتكون 3: 1 عندما نمت BCG lux في المختبر في مرق Middlebrook 7H9.
    5. قم
  5. بالطرد المركزي للثقافة عند 2،175 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لحبيبات الخلايا والتخلص من المادة الطافية في مطهر مناسب له نشاط مبيد للجراثيم معروف. تخلص من جميع مخلفات الاستزراع بالمطهرات المناسبة للبكتيريا الفطرية وفقا للإرشادات المحلية.
  6. اغسل حبيبات الخلية مرتين في PBS التي تحتوي على 0.05٪ بولي سوربات 80 (PBS-T) لمنع التكتل البكتيري.
  7. بعد الغسيل النهائي ، صب النفايات الطافية ، وإعادة تعليق حبيبات الخلية الفطرية في PBS-T ، وتخفيف معلق البكتيريا الفطرية إلى كثافة الخلية المطلوبة باستخدام قياسات RLU.
  8. قم بإعداد تخفيفات تسلسلية بمقدار عشرة أضعاف لللقاح في ألواح 24 بئرا باستخدام PBS-T. ضع 10 ميكرولتر على ألواح أجار Middlebrook 7H11 (0.5٪ جلسرين ، 50 ميكروغرام / مل هيغروميسين ، 10٪ حمض الأوليك ، ألبومين ، سكر العنب ، كاتالاز [OADC]) في نسختين لتعداد عدد اللقاح CFU.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أنبوب تفاعل 1.5 مل (إيبندورف) إيبندورف 22431021 ماصة 20 و200 و1000 ميكرولتر وأطراف مفلترة أي مورد غير متاح 24 بئر لوحة ثقافة غرينر 662160 [م] 25 مل ماصات وماصة صبي أي مورد غير متاح 3 مقصورات طبق بتري (94/15 مم) غرينر 637102 الطرد المركزي أي مورد غير متاح خزانة السلامة من الفئة الثانية أي مورد غير متاح الإيثانول (>99.7٪) VWR 208221.321 الجلسرين سيجما ألدريتش جي 5150 هيغروميسين ب كورنينج 30-240 كرون مقياس الإضاءة (Autolumat LB 953) نسومبو 34622 أنابيب مقياس الإضاءة كورنينج 352054 أجهزة الطرد المركزي الدقيقة أي مورد غير متاح ميدلبروك 7H11 أجار BD Bioscience هاتف: 283810 مرق ميدلبروك 7H9 BD Bioscience هاتف: 271310 إثراء ميدلبروك ADC BD Bioscience 212352 إثراء ميدلبروك OADC BD Bioscience هاتف: 212240 المتفطرة بوفيس بي سي جي لوكس مختلف غير متاح ن-ديسيل ألدهيد سيجما ألدريتش D7384-100G حاضنة الاهتزاز المداري أي مورد غير متاح محلول ملحي مخزن بالفوسفات سيجما ألدريتش P4417-100TAB بولي سوربات 80 (توين -80) سيجما ألدريتش P8074-500 مل قارورة إرلينماير بغطاء مهواة (250 مل) كورنينج CLS40183 وينترم (الإصدار 1.08) نسومبو غير متاح برنامج LB953.TTB

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

7H9

مقالات ذات صلة