ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الأعمال الموضحة أدناه في مختبر CL2 داخل خزانة السلامة الميكروبيولوجية من الفئة 2 (MSC) وفقا لإرشادات الصحة والسلامة المحلية.
< p class = "jove_title" >
1. تحضير M. bovis BCG lux للعدوى
- قم بإذابة مخزون الجلسرين المجمد سعة 1.2 مل (15٪) من M. bovis BCG lux ، سلالة لقاح مونتريال التي تحولت مع البلازميد المكوكي pSMT1 الذي يحمل جينات luxAB من Vibrio harveyi التي تشفر إنزيم لوسيفيراز.
- تلقيح 15 مل من مرق ميدلبروك 7H9 الذي يحتوي على 0.2٪ جلسرين ، و 10٪ ألبومين ، وسكر العنب ، وتخصيب الكاتلاز (ADC) ، و 50 ميكروغرام / مل hygromycin مع 1.2 مل من BCG lux ، في قارورة Erlenmeyer تحمل علامة 250 مل.
- ضع القارورة في حاوية محكمة الغلق للسلامة الحيوية واحتضانها عند 37 درجة مئوية في حاضنة شاكر مدارية عند 220 دورة في الدقيقة لمدة 72 ساعة (أو حتى تصل المزرعة إلى مرحلة منتصف السجل من النمو).
- تحقق من نمو ثقافة BCG lux عن طريق تحضير تخفيفات 1:10 للثقافة في أنابيب مقياس الإضاءة باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ، درجة الحموضة 7.4 ، 0.01 M عازلة الفوسفات ، 0.0027 M كلوريد البوتاسيوم ، 0.137 M كلوريد الصوديوم) في نسختين. دوامة ، وتحميل أنابيب مقياس الإضاءة في مقياس الإضاءة وقياس التلألؤ البيولوجي (وحدة الضوء النسبي [RLU] / مل) باستخدام n-decyl aldehyde كركيزة (1٪ v / v في الإيثانول المطلق).
ملاحظه: تم تحديد نسبة وحدات تشكيل RLU / مستعمرة (CFU) سابقا لتكون 3: 1 عندما نمت BCG lux في المختبر في مرق Middlebrook 7H9.
قم - بالطرد المركزي للثقافة عند 2،175 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لحبيبات الخلايا والتخلص من المادة الطافية في مطهر مناسب له نشاط مبيد للجراثيم معروف. تخلص من جميع مخلفات الاستزراع بالمطهرات المناسبة للبكتيريا الفطرية وفقا للإرشادات المحلية.
- اغسل حبيبات الخلية مرتين في PBS التي تحتوي على 0.05٪ بولي سوربات 80 (PBS-T) لمنع التكتل البكتيري.
- بعد الغسيل النهائي ، صب النفايات الطافية ، وإعادة تعليق حبيبات الخلية الفطرية في PBS-T ، وتخفيف معلق البكتيريا الفطرية إلى كثافة الخلية المطلوبة باستخدام قياسات RLU.
- قم بإعداد تخفيفات تسلسلية بمقدار عشرة أضعاف لللقاح في ألواح 24 بئرا باستخدام PBS-T. ضع 10 ميكرولتر على ألواح أجار Middlebrook 7H11 (0.5٪ جلسرين ، 50 ميكروغرام / مل هيغروميسين ، 10٪ حمض الأوليك ، ألبومين ، سكر العنب ، كاتالاز [OADC]) في نسختين لتعداد عدد اللقاح CFU.
< p class = "jove_title" >
2. تحضير يرقات G. mellonella
- قم بشراء اليرقات الأخيرة من الطور الأخير من مصادر مناسبة وحافظ على اليرقات في الظلام عند 18 درجة مئوية عند الوصول واستخدمها في غضون أسبوع واحد من الشراء. بدلا من ذلك ، يمكن تربية اليرقات ذاتيا باتباع بروتوكول Jojāo et al. بالنسبة لليرقات المشتراة ، تخلص من أي يرقات ميتة أو متغيرة اللون أو خادرة قبل التخزين.
ملاحظه: يمكن تمييز اليرقات الشرانقة شكليا عن يرقات الطور الأخير.
- تحديد واختيار اليرقات السليمة للتجريب ، بناء على لون كريم موحد مع تغير طفيف أو معدوم في اللون (الميلانيز) ، والحجم (2-3 سم في الطول) ، والوزن (حوالي 250 مجم) ، وإظهار مستوى عال من الحركة ، وامتلاك القدرة على تصحيح نفسها عند قلبها.
- عد اليرقات السليمة بعناية (بحد أدنى 20-30 لكل مجموعة) في طبق بتري (94/15 مم) مبطن بطبقة من ورق الترشيح (94/15 مم) باستخدام ملاقط غير حادة لتقليل التلوث وتخزينها في درجة حرارة الغرفة في الظلام حتى الاستخدام.
< p class = "jove_title" >
3. إصابة G. mellonella ب BCG lux
- قلل من الفوضى داخل MSC لتقليل مخاطر التلوث وإصابة وخز الإبرة.
- قم بإعداد منصة الحقن عن طريق لصق ورق ترشيح دائري (94 مم) على سطح مرتفع مستو. يمكن استخدام الأسطح الناعمة أو الصلبة وتعتمد كليا على تفضيلات المستخدم ، على سبيل المثال ، أغطية علب الماصة أو إسفنجة تنظيف النايلون.
- قم بتعقيم حقنة دقيقة سعة 25 ميكرولتر (25 جم) عن طريق شفط 3 أحجام من 70٪ من الإيثانول وشطفها ب 3 أحجام من PBS-T المعقمة.
- استنشق 10 ميكرولتر من لقاح BCG lux (المحضر في القسم 1) أو PBS-T في المحقنة المجهرية المعقمة 25 ميكرولتر. استخدم حقنة منفصلة للتحكم السلبي PBS-T.
ملاحظه: قم بتعليق لقاح BCG lux بعد 10 حقن لضمان تعليق خلوي موحد.
- استخدم الملقط لالتقاط يرقة واحدة ووضعها على منصة الحقن.
- على المنصة ، اقلب اليرقة على ظهرها وقم بشل حركتها عن طريق تأمين الرأس والذيل بالملاقط. حدد موقع آخر مقدمة يسرى تقوم بالعد التنازلي من رأس اليرقة وأدخل طرف الإبرة بعناية (5-6 مم) بزاوية 10-20 درجة إلى المستوى الأفقي.
ملاحظه: تسمح الملقط القصير والضيق بالشلل السهل مع الحد الأدنى من إجهاد اليرقات. انتبه إلى عدم الإفراط في الاختراق الذي قد يثقب الأمعاء ويسبب الميلانين أو الموت غير BCG Lux.
- عد اليرقات المصابة في طبق بتري مبطن بطبقة من ورق الترشيح ، يمكن أن يستوعب طبق بتري واحد مقاس 90 مم ما يصل إلى 30 يرقة.
- قم بتخزين طبق بتري الذي يحتوي على اليرقات في صندوق مظلم جيد التهوية أو غير مغلق داخل حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
< p class = "jove_title" >
4. مراقبة بقاء G. mellonella بعد الإصابة
- على مدار الوقت ، راقب بقاء اليرقات كل 24 ساعة. تعتبر اليرقات ميتة عندما تفشل في التحرك استجابة للمس.
