ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الأعمال الموضحة أدناه في مختبر CL2 داخل خزانة السلامة الميكروبيولوجية من الفئة 2 (MSC) وفقا لإرشادات الصحة والسلامة المحلية.
1. التحضير من M. bovis BCG lux للعدوى
- قم بإذابة مخزون مجمد سعة 1.2 مل من الجلسرين (15٪) من المتفطرة بوفيس Bacillus Calmette-Guérin (BCG) lux ، سلالة لقاح مونتريال التي تحولت مع البلازميد المكوكي pSMT1 الذي يحمل luxAB الجينات من Vibrio harveyi لترميز إنزيم لوسيفيراز.
- تلقيح 15 مل من مرق Middlebrook 7H9 الذي يحتوي على 0.2٪ جلسرين ، و 10٪ ألبومين ، وسكر العنب ، وتخصيب الكاتلاز (ADC) ، و 50 ميكروغرام / مل hygromycin مع 1.2 مل من BCG lux ، في قارورة Erlenmeyer مسمى 250 مل.
- ضع القارورة في حاوية محكمة الغلق للسلامة الحيوية واحتضانها عند 37 درجة مئوية في حاضنة شاكر مدارية عند 220 دورة في الدقيقة لمدة 72 ساعة (أو حتى تصل المزرعة إلى مرحلة منتصف السجل من النمو).
- تحقق من نمو ثقافة BCG lux عن طريق تحضير تخفيفات 1:10 للثقافة في أنابيب مقياس الإضاءة باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS ، درجة الحموضة 7.4 ، 0.01 M عازلة الفوسفات ، 0.0027 M كلوريد البوتاسيوم ، 0.137 M كلوريد الصوديوم) في نسختين. دوامة ، وتحميل أنابيب مقياس الإضاءة في مقياس الإضاءة وقياس التلألؤ الحيوي (وحدة الضوء النسبي [RLU] / مل) باستخدام n-decyl aldehyde كركيزة (1٪ v / v في الإيثانول المطلق).
ملاحظة: تم تحديد نسبة وحدات تشكيل المستعمرة (CFU) سابقا لتكون 3: 1 عندما نمت BCG lux في المختبر في مرق Middlebrook 7H9.
- الطرد المركزي للثقافة عند 2,175 × g لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لحبيبات الخلايا والتخلص من المادة الطافية في مطهر مناسب له نشاط مبيد للجراثيم معروف. تخلص من جميع مخلفات الاستزراع بالمطهرات المناسبة للبكتيريا الفطرية وفقا للإرشادات المحلية.
- اغسل حبيبات الخلية مرتين في PBS التي تحتوي على 0.05٪ بولي سوربات 80 (PBS-T) لمنع التكتل البكتيري.
- بعد الغسيل النهائي ، صب النفايات الطافية ، وإعادة تعليق حبيبات الخلية الفطرية في PBS-T ، وتخفيف معلق البكتيريا الفطرية إلى كثافة الخلية المطلوبة باستخدام قياسات RLU.
- قم بإعداد تخفيفات تسلسلية بمقدار عشرة أضعاف لللقاح في ألواح 24 بئرا باستخدام PBS-T. ضع 10 ميكرولتر على ألواح أجار Middlebrook 7H11 (0.5٪ جلسرين ، 50 ميكروغرام / مل هيغروميسين ، 10٪ حمض الأوليك ، ألبومين ، سكر العنب ، كاتالاز [OADC]) في نسختين لتعداد عدد اللقاح CFU.
2. تحضير G. mellonella يرقات
- قم بشراء اليرقات الأخيرة من الطور الأخير من مصادر مناسبة وحافظ على اليرقات في الظلام عند 18 درجة مئوية عند الوصول واستخدمها في غضون أسبوع واحد من الشراء. بدلا من ذلك ، يمكن تربية اليرقات ذاتيا باتباع بروتوكول Jojāo et al. بالنسبة لليرقات المشتراة ، تخلص من أي يرقات ميتة أو متغيرة اللون أو متشرخة قبل التخزين.
ملاحظة: يمكن تمييز اليرقات الشرانقة شكليا عن يرقات الطور الأخير.
- تحديد واختيار اليرقات السليمة للتجريب ، بناء على لون كريم موحد مع تغير طفيف أو معدوم في اللون (الميلانيز) ، والحجم (2-3 سم في الطول) ، والوزن (حوالي 250 مجم) ، وإظهار مستوى عال من الحركة ، وامتلاك القدرة على تصحيح نفسها عند قلبها.
- عد اليرقات السليمة بعناية (بحد أدنى 20-30 لكل مجموعة) في طبق بتري (94/15 مم) مبطن بطبقة من ورق الترشيح (94/15 مم) باستخدام ملاقط غير حادة لتقليل التلوث وتخزينها في درجة حرارة الغرفة في الظلام حتى الاستخدام.
3. إصابة G. mellonella ب BCG lux
- قلل من الفوضى داخل MSC لتقليل مخاطر التلوث وإصابة وخز الإبرة.
- قم بإعداد منصة الحقن عن طريق لصق ورق ترشيح دائري (94 مم) على سطح مرتفع مستو. يمكن استخدام الأسطح الناعمة أو الصلبة وتعتمد كليا على تفضيلات المستخدم ، على سبيل المثال ، أغطية علب الماصة أو إسفنجة تنظيف النايلون.
- قم بتعقيم حقنة دقيقة سعة 25 ميكرولتر (25 جم) عن طريق شفط 3 أحجام من 70٪ من الإيثانول وشطفها ب 3 أحجام من PBS-T المعقمة.
- استنشق 10 ميكرولتر من لقاح BCG lux (محضر في القسم 1) أو PBS-T في المحقنة المجهرية المعقمة 25 ميكرولتر. استخدم حقنة منفصلة للتحكم السلبي PBS-T.
ملاحظة: قم بتعليق لقاح BCG lux بعد 10 حقن لضمان تعليق خلوي موحد.
- استخدم الملقط لالتقاط يرقة واحدة ووضعها على منصة الحقن.
- على المنصة ، اقلب اليرقة على ظهرها وقم بشل حركتها عن طريق تأمين الرأس والذيل بالملاقط. حدد موقع آخر مقدمة لليسار تقوم بالعد التنازلي من رأس اليرقة وأدخل طرف الإبرة بعناية (5-6 مم) بزاوية 10-20 درجة إلى المستوى الأفقي.
ملاحظة: تسمح الملقط القصير والضيق بالشلل السهل مع الحد الأدنى من إجهاد اليرقات. انتبه إلى عدم الإفراط في الاختراق الذي قد يثقب القناة الهضمية ويسبب عدم BCG lux ميلانين أو موت محدد.
- عد اليرقات المصابة في طبق بتري مبطن بطبقة من ورق الترشيح ، يمكن أن يستوعب طبق بتري واحد مقاس 90 مم ما يصل إلى 30 يرقة.
- قم بتخزين طبق بتري الذي يحتوي على اليرقات في صندوق مظلم مجيد التهوية أو غير مغلق داخل حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 .
4. مراقبة بقاء G. mellonella بعد الإصابة
- على مدار الوقت ، راقب بقاء اليرقات كل 24 ساعة. تعتبر اليرقات ميتة عندما تفشل في التحرك استجابة للمس.
5. قياس في الجسم الحي عبء BCG lux في G. mellonella
- في كل نقطة زمنية ، اختر عشوائيا خمس يرقات مصابة تم إعدادها مسبقا في القسم 3 وقم بتعقيم أسطح اليرقات برفق باستخدام مسحات براعم القطن المنقوعة في 70٪ من الإيثانول.
ملاحظة: هذه الخطوة مهمة عند طلاء اليرقات المتجانسة لتعداد CFU الفطري لأن اليرقات غير المعقمة يمكن أن تؤدي إلى التلوث.
- ضع اليرقات بشكل فردي في أنابيب مصفوفة تحلل سعة 2 مل تحتوي على 800 ميكرولتر من PBS المعقم.
- تجانس اليرقات باستخدام الخالط لمدة 60 ثانية بسرعة 6.0 م / ث.
- قم بالطرد المركزي لأنابيب التحلل عند 3,500 × g لمدة 5 ثوان لإزالة التجانس من الأغطية ، وصب الجانس بعناية في أنابيب مقياس الإضاءة المعقمة بشكل فردي.
ملاحظة: لتعداد CFU (الخطوة 5.7) ، تأكد من الاحتفاظ ب 100 ميكرولتر من الجانس في أنبوب تفاعل معقم 1.5 مل.
- استرجع أي متجانس متبقي عن طريق غسل أنابيب مصفوفة التحليل ب 1 مل من PBS-T والماصة في أنابيب مقياس الإضاءة المقابلة.
- دوامة أنابيب مقياس الإضاءة وقياس التلألؤ الحيوي للمجانسات الموصوفة سابقا في الخطوة 1.4.
- قم بإعداد تخفيفات تسلسلية بعشرة أضعاف من المتجانس في ألواح استزراع 24 بئرا باستخدام PBS-T. قم بإخراج 10 ميكرولتر من التخفيف على ألواح أجار Middlebrook 7H11 التي تحتوي على 0.5٪ جلسرين ، و 50 ميكروغرام / مل هيغرومايسين ، و 10٪ OADC ، و 20 ميكروغرام / مل من البيبيراسيلين ، لتحديد نسبة RLU / CFU ل BCG lux بعد العدوى في الجسم الحي.
ملاحظة: يقضي البيبيراسيلين على G. mellonella الجراثيم مع الحد الأدنى من تثبيط نمو BCG lux.
