القياس الكمي لحمل هيليكوباكتر بيلوري في معدة الفأر المصابة

الملخص

المصدر: D'Costa ، K. et al. ، نماذج الفئران لعدوى الملوية وأمراض المعدة. J. Vis. Exp. (2018)

في هذا الفيديو ، نصف بروتوكولا لتحديد حمل هيليكوباكتر بيلوري في أنسجة معدة الفئران بعد الإصابة لتأكيد استعمارها.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تأكيد الاستعمار البكتيري في المعدة بعد العدوى

1. عد قابل للتطبيق من الملوية البوابية في المعدة
   1. استكمل ألواح HBA المعقمة بالمضادات الحيوية الإضافية (200 ميكروغرام / مل من الباسيتراسين و 10 ميكروغرام / مل حمض الناليديكسيك) قبل إجراء تعداد المستعمرات من معدة الفئران المصابة.
   2. قم بتجانس أقسام المعدة إما يدويا ، باستخدام مدقات صغيرة من مادة البولي بروبيلين القابلة للتعقيم ، أو باستخدام أداة تفكك ميكانيكية (انظر جدول المواد).
   3. قم بإعداد تخفيفات تسلسلية مكررة (10⁻¹ إلى 10⁻²) من متجانسات المعدة الناتجة في BHI المعقمة.
      ملاحظه: يجب تحديد التخفيفات بناء على الأحمال البكتيرية النموذجية التي تم الحصول عليها لسلالة معينة من بكتيريا الملوية البوابية المستخدمة للعدوى ، بالإضافة إلى مدة الإصابة. يمكن أيضا استخدام عينات غير مخففة.
   4. قسم ألواح HBA المجففة مسبقا (ملاحظة: من أجل ضمان عزل المستعمرات الفردية ، يجب تسخين ألواح HBA وتجفيفها في خزانة أمان بيولوجية أو حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة قبل الاستخدام.) إلى ثلاثة أو أربعة أجزاء. باستخدام تكييف تقنية مايلز وميسرا ، أضف 10-100 مل من كل تخفيف على جزء من لوحة أجار ووزعها باستخدام حلقات بلاستيكية معقمة.
   5. اترك الألواح تجف ثم ضعها في وضع مقلوب (جانب الغطاء لأسفل) في برطمانات غاز لاهوائية. للحفاظ على الرطوبة في البرطمانات ، قم بتضمين طبق بتري يحتوي على الماء.
   6. احتضان البرطمانات عند 37 درجة مئوية حتى تتشكل المستعمرات (عادة 4-7 أيام).
   7. تعداد المقطع (الأجزاء) التي تحتوي على ما بين 10 و 100 مستعمرة معزولة.
      ملاحظة: يمكن تمييز مستعمرات الملوية البوابية و H. felis على الألواح عن تلك الخاصة بالأعضاء الآخرين في ميكروبات المعدة الفئرانية باستخدام اختبارات اليورياز والكاتالاز والأوكسيداز القياسية. الملوية البوابية والملوية البكتيرية الفيسية إيجابية لجميع الاختبارات الثلاثة.
   8. احسب الأحمال البكتيرية ك (CFU / g من الأنسجة) ، باستخدام الصيغة التالية:
      [(متوسط عدد المستعمرات المحسوبة) × (عامل التخفيف) × (مغطى بالحجم)] / (وزن المعدة).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الكواشف البكتريولوجية قاعدة أجار الدم الأكسويد رقم 2 ثيرمو فيشر العلمي CM0271B يذوب في الماء منزوع الأنون قبل التعقيم دم الحصان الممتاز منزوع الضربات البيولوجيا الأخلاقية الأسترالية PDHB100 مرق تسريب القلب باكتو الدماغ BD Bioscience هاتف: 237500 يذوب في الماء منزوع الأنون قبل التعقيم حزم غاز CampyGen ثيرمو فيشر العلمي CN0035A / CN0025A المضادات الحيويه فانكومايسين سيجما ألدريتش V2002-1G تذوب في الماء منزوع الأيونات بوليميكسين ب سيجما ألدريتش P4932-5MU تذوب في الماء منزوع الأيونات تريميثوبريم (≥98٪ HPLC) سيجما ألدريتش تي 7883 يذوب في 100٪ (مطلق) الإيثانول أمفوتريسين أمريسكو (النجوم العلمية) E437-100 ملغ تذوب في الماء منزوع الأيونات العصيات من Bacillus licheniformis سيجما ألدريتش ب0125 تذوب في الماء منزوع الأيونات حمض النالاديكسيك سيجما ألدريتش N8878 تذوب في الماء منزوع الأيونات المعدات والأواني البلاستيكية الجرار اللاهوائية الأكسويد ثيرمو فيشر العلمي HP0011 / HP0031 كوبان باستور ماصات خدمات Interpath 200 ع 01 جهاز الطرد المركزي Eppendorf 5810R اجمع الكريات البكتيرية عن طريق الطرد المركزي عند 2,200 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية بارافيلم م بيميس ، VWR PM996 مدقة Eppendorf الدقيقة لأنابيب 1.2 - 2 مل سيجما ألدريتش Z317314 مدقات البولي بروبلين القابلة للتعقيم المستخدمة في تجانس المعدة GentleMACs Dissociator ميلتيني بيوتيك 130-093-235 استخدم برامج MACS لطيفة محددة مسبقا لأنسجة معدة الفأر أنابيب M (غطاء برتقالي) ميلتيني بيوتيك 30-093-236 مقياس الفلور كيوبيت ثيرمو فيشر العلمي س 33216 حلقة بلاستيكية معقمة لاب سيرف LBSLP7202