إنشاء نموذج لعدوى المسالك البولية في إناث الفئران

الملخص

المصدر: Zychlinsky Scharff ، A. et al. ، عدوى المسالك البولية في نموذج حيواني صغير: قسطرة عبر الإحليل لذكور وإناث الفئران.J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو تأسيس عدوى الإشريكية القولونية المسببة للبول في مثانة الفئران الأنثوية من خلال تقطير القسطرة عبر الإحليل. نجحت البكتيريا المحقونة في إنشاء عدوى في المسالك البولية داخل المثانة ، مما يوفر منصة قيمة لدراسة الأمراض المرتبطة بالرعاية الصحية المتعلقة بالمسالك البولية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحضير القسطرة

1. قم بإعداد قنية واحدة للأطفال للوصول إلى الوريد لكل مجموعة من الفئران المصابة. باستخدام آلية الزنبرك المدمجة ، قم بتجريد كل قنية من إبرتها ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تخلص من الإبر ، مع الحفاظ على القنية البلاستيكية الوريدية فقط.
2. عقيم القسطرة في غطاء التدفق الرقائقي لدورة واحدة من الأشعة فوق البنفسجية (UV) ، عادة 25 - 30 دقيقة
   ملاحظه: يمكن استخدام القسطرة لأكثر من فأر واحد ، ومع ذلك ، يجب استخدام قسطرة جديدة بين المجموعات التجريبية أو الجنسين أو السلالات البكتيرية.

فئة

2. تحضير الإشريكية القولونية المسببة للبول للعدوى

1. قبل يومين على الأقل من الإصابة ، باستخدام حلقة تلقيح معقمة ، قم بربط الإشريكية القولونية المسببة للبول (UPEC) من مخزون بكتيري مجمد على صفيحة أجار مرق لوريا (LB) ، تحتوي على مضادات حيوية إذا كان ذلك مناسبا. احتضن عند 37 درجة مئوية طوال الليل. يمكن تخزين الأطباق عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
2. في قارورة Erlenmeyer معقمة سعة 100 مل ، قم بتلقيح 10 مل من LB ، التي تحتوي على مضادات حيوية إذا كان ذلك مناسبا ، بمستعمرة واحدة من صفيحة LB واحتضانها عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها (حوالي 16 - 18 ساعة).
   ملاحظه: تسمح الثقافات الدائمة بالتعبير عن النوع 1 pili ، وهو أمر ضروري للعدوى. سيكون للثقافات التي نمت بالاهتزاز تعبير بيلي أقل كفاءة ، وبالتالي معدلات غير متسقة للإصابة.
3. قم بقياس الكثافة الضوئية (OD) ₆₀₀ للثقافة الليلية واحسب عدد البكتيريا لكل مل باستخدام منحنى نمو محدد مسبقا. على سبيل المثال ، بالنسبة لسلالة UPEC UTI89 ، OD₆₀₀ = 0.35 يعادل 2 × 10⁸ وحدة تشكيل مستعمرة (CFU) لكل مل ، وبالتالي ، فإن الثقافة الليلية مع OD₆₀₀ = 2.4 ستكون معادلة ل 13.7 × 10⁸ CFU لكل مل. حدد تجريبيا العلاقة بين OD₆₀₀ والبكتيريا القابلة للحياة مع كل سلالة جديدة تستخدم للعدوى.
4. تحديد عدد البكتيريا المطلوبة من خلال النظر في عدد المصابة وأن كل فأر يجب أن يتلقى ما يقرب من 10⁷ وحدات مكونة للمستعمرة (CFU) في 50 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). قم بتضمين الحجم الميت ~ 130 ميكرولتر للقسطرة والحقنة و 100 ميكرولتر اللازمة لتحديد اللقاح.
   1. قم بتدوير المعلق البكتيري في جهاز طرد مركزي دقيق منضدي عند 17,000 × جم لمدة 1 دقيقة وأعد تعليق الحبيبات البكتيرية الناتجة عند 2 × 10⁸ CFU لكل مل في PBS. قم بتخفيف كمية من هذا المعلق بشكل متسلسل وقم بتثبيتها على أجار LB ، مع المضادات الحيوية إذا كان ذلك مناسبا ، لتحديد اللقاح الدقيق لكل عدوى.
5. اسحب اللقاح البكتيري في حقنة سعة 1 مل وقم بتوصيل القسطرة بنهاية المحقنة. اضغط على المحقنة لإزالة أي هواء واضغط على المكبس لملء مساحة الهواء الميت في القسطرة قبل البدء في التقطير.

< ص الفئة = "jove_title" >3. تحضير الفئران

1. تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق بمقدار 100 مجم / كجم من الكيتامين و 5 مجم / كجم زيلازين. يمكن توفير حرارة إضافية.
2. تأكد من تخدير كل ماوس بالكامل عن طريق الضغط على وسادة القدم بضغط متوسط. يتم تخدير الفئران بالكامل عندما لا تتفاعل وتتطلب 3-5 دقائق للوصول إلى هذه الحالة.
3. ضع الفئران ضعيفة واضغط على أسفل البطن لتفريغ المثانة من البول. تبدو المثانة الممتلئة وكأنها حبة بازلاء تحت الجلد بين القمم الحرقفية.
   ملاحظه: تم استخدام الأيزوفلوران المستنشق لقسطرة إناث الفئران ، ومع ذلك ، لم يتم اختبار ما إذا كانت ذكور الفئران مخدرة بشكل كاف عن طريق الأيزوفلوران المستنشق لهذا الإجراء.

< p class = "jove_title" >4. التقطير عبر الإحليل للإناث الفئران

1. باستخدام اليد غير المهيمنة ، ضع الإبهام على الذيل وإصبع من نفس اليد على بطن الماوس واضغط برفق في اتجاهات متعارضة لتثبيت الماوس بإحكام في مكانه.
2. ضع طرف القسطرة بشكل عمودي على الفأر عند فتحة مجرى البول. بضغط خفيف ، حرك القسطرة في مجرى البول ، حتى يلتقي المحور بفتحة مجرى البول ، مع خفض المحقنة في نفس الوقت بحيث تكون موازية لسطح العمل. لا تتطلب القسطرة أي تزييت. لا تدفع القسطرة أو تجبرها على الدخول إلى مجرى البول. يجب أن تنزلق القسطرة بسلاسة وسهولة في مجرى البول ، مع مقاومة قليلة أو معدومة.
   1. قبل غرس اللقاح (الخطوة 4.3) ، بمجرد وضع القسطرة في مكانها ، اسحب جلد البطن برفق شديد نحو رأس الفأر بإصبع من اليد غير المهيمنة الموجودة بالفعل على بطن الفأر (الخطوة 4.1). إذا كانت القسطرة في مجرى البول ، فلن تتحرك الأنسجة المكونة لفتحة مجرى البول ، بينما إذا تم وضع القسطرة بشكل غير صحيح في المهبل ، فسوف يتحرك النسيج لأعلى وبعيدا عن القسطرة. يجب إجراء هذا الاختبار السريع على كل ماوس.
3. عندما يلتقي محور القسطرة بفتحة مجرى البول ، قم بتوزيع 50 ميكرولتر من اللقاح البكتيري ببطء. يقلل معدل التقطير البطيء من الارتجاع المثاني الحالبي إلى الكلى. قم بإزالة القسطرة ببطء لمنع التسرب ، أكثر من 5. ضع الفئران في أقفاصها في وضع ضعيف.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات قسطرة BD Insyte Autoguard Shielded IV 24G ، قطر خارجي 0.7 مم ، طول 14 ملم BD الطبية 381811 أو 381411* * رقم الكتالوج يعتمد على البلد حلقة التلقيح غرينر بيو ون 731171 مرق LB ميلر ديفكو هاتف: 244620 أجار LB ميلر ديفكو هاتف: 244520 كوفيت بيو راد هاتف: 223-9955 محاقن بي براون 9166017 فولت حقنة الأنسولين تيرومو BS05M2913