$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. تحليل التدفق الخلوي لأنسجة المثانة
- تحضير المخزن المؤقت للهضم الذي يحتوي على الكولاجيناز عند 34 وحدة / مل و DNase عند 100 ميكروغرام / مل ، في PBS. ابق على الجليد. قم بإعداد أنبوب مخروطي واحد سعة 15 مل لكل ليتم تحليله وتناول 1 مل من المخزن المؤقت للهضم لكل أنبوب.
- في نقاط زمنية محددة مسبقا ، قم بالتضحية بالفئران باستخدام إجراءات التشغيل القياسية المعتمدة (على سبيل المثال ، خلع عنق الرحم أو جرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون). بلل البطن جيدا بنسبة 70٪ من الإيثانول لتقليل التلوث بالفراء.
- قم بعمل شق عبر الثلث السفلي من بطن الفأر لا يقل عن 2 سم باستخدام المقص وإزالة المثانة بأكملها. افرم جيدا بالمقص ، وقطع المثانة إلى قطع بحجم 2-3 مم2 ، عادة حوالي 8 قطع.
- أضف مثانة مفرومة واحدة لكل أنبوب يحتوي على عازلة الهضم. رج العبوة لغسل أنسجة المثانة المفرومة في المخزن المؤقت للهضم. استمر في وضع الثلج حتى يتم تشريح جميع المثانات وفرمها.
- احتضان المثانات المفرومة لمدة 60-75 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، مع رج قوي باليد لمدة 5 ثوان كل 15 دقيقة. عندما يكون للأنسجة مظهر زجاجي شفاف ، يشبه المناديل الورقية المبللة ، يكتمل الهضم. سيؤدي الهضم المطول إلى إزالة البروتينات السطحية من الخلايا اللازمة لتحديد الهوية ويجب تجنبها.
- قم بتعطيل إنزيمات الهضم عن طريق إضافة 2-3 مل من المخزن المؤقت لقياس التدفق الخلوي المثلج (PBS الذي يحتوي على 2٪ مصل بقري جنين (FBS) و 0.2 ملي EDTA) واخلطه برفق. ضع الأنابيب على الجليد.
- لضمان تعليق أحادي الخلية وإزالة أي نسيج ضام ، قم بتمرير محتويات الأنبوب عبر مرشح 100 ميكرومتر يوضع في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. اضغط برفق على أي أنسجة متبقية من خلال الفلتر بنهاية مكبس المحقنة. اغسل الفلتر بمخزن مؤقت إضافي لقياس التدفق الخلوي سعة 2 مل. احتفظ بالعينات على الجليد.
- اغسل العينات بالطرد المركزي لمدة 7 دقائق عند 200 × جم ، 4 درجات مئوية. أعد تعليق الكريات في مخزن مؤقت لقياس التدفق الخلوي 100 ميكرولتر يحتوي على كتلة Fc ، مخففة إلى 5 ميكروغرام / مل ، ونقلها إلى صفيحة سفلية مستديرة 96 بئر. بعد 10 - 15 دقيقة ، أضف 100 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة المطلوبة إلى كل عينة. احتضان العينات لمدة 30 - 45 دقيقة ، على الجليد ، محمية من الضوء.
ملاحظه: كتلة Fc هي كاشف يستخدم لمنع ارتباط جزء Fc من الأجسام المضادة بالخلايا التي تعبر عن مستقبلات Fc. والغرض منه هو تقليل ارتباط الأجسام المضادة غير المحددة. يعتمد تحديد الأجسام المضادة المراد استخدامها على الفرضية التي يتم اختبارها في التجربة ويجب اختيارها بمدخلات من الأدبيات. في الشكل 1 ، لقياس التسلل الكلي للخلايا المناعية ، تم استخدام جسم مضاد مضاد ل CD45 ، وهو بروتين خلوي مناعي.
- اغسل العينات بالطرد المركزي لمدة 7 دقائق عند 200 × جم ، 4 درجات مئوية. قم بتعليق كريات الخلايا في مخزن مؤقت لقياس التدفق الخلوي 200 ميكرولتر وقم بتمرير العينات عبر مصفاة خلية 40 ميكرومتر على أنبوب بوليسترين سعة 5 مل قبل الاستحواذ على مقياس التدفق الخلوي.
- اجمع العينة بأكملها على مقياس التدفق الخلوي. سينتج عن الهضم الجيد 200,000 - 400,000 خلية ، مع 8,000 - 10,000 خلية مناعية CD45 + من مثانات الفأر الساذجة ، بينما ستحتوي الأعضاء المصابة على المزيد من الخلايا (الشكل 1).
ملاحظه: لا يمكن استخدام العينات المعدة لتحليل قياس التدفق الخلوي لتقييم CFU. لا ينصح بتقسيم المثانة إلى قسمين حيث لا يوجد دليل يثبت أن استعمار الإشريكية القولونية المسببة للبول (UPEC) أو تسلل الخلايا المناعية موحد في جميع أنحاء الأنسجة.
