تقنية لإنشاء نموذج عدوى بكتيرية في مزرعة الأعضاء خارج الجسم الحي

الملخص

المصدر: Rizzuto, G.A., et al. مزارع المشيمة والأعضاء المتساقطة البشرية لدراسة الالتهابات في واجهة الأم والجنين. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو طريقة لإنشاء نموذج عدوى في أنسجة المشيمة لدراسة انتشار العدوى. تصاب زراعة الأعضاء المشيمية خارج الجسم الحي ب Listeria monocytogenes ، وهو طفيلي اختياري داخل الخلايا. تغزو البكتيريا الأرومات الغاذية خارج الزغابات (EVTs) لدخول أنسجة المشيمة ثم تنتشر إلى خلايا أخرى عن طريق انتشار خلية إلى أخرى.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

< p class = "jove_title" >1. تحضير لوحات ثقافة الأعضاء

ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوات التالية باستخدام تقنية معقمة في غطاء زراعة الأنسجة. إنه مثالي ليكون المجهر التشريح موجودا في حقل معقم. ومع ذلك ، هذا ليس ضروريا تماما طالما يتم إجراء التشريح الدقيق بسرعة ، ويتم غمس الأدوات بشكل متكرر في 70٪ من الإيثانول.

1. قم بإذابة قارورة (قوارير) المصفوفة خارج الخلية (ECM) على الجليد. قم بتخفيف وحدة التحكم في الميكروفون 1:1 باستخدام وسائط التجميع المثلجة الباردة، واخلطها عن طريق سحب العينات. الماصة ببطء لتجنب إدخال الفقاعات. يتطلب كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار 100 ميكرولتر من هذا التعليق وسوف يستوعب 3-4 مزارع أعضاء.
2. ضع إدخالات الآبار (حجم المسام 0.4 ميكرومتر) في كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 6 آبار.
3. قم بتغطية كل ملحق transwell بطبقة رقيقة (100 ميكرولتر) من تعليق ECM / الوسائط.
4. ضع اللوحة على الجليد وانتقل على الفور إلى إنشاء ثقافات الأعضاء. بدلا من ذلك ، قم بإعداد اللوحة قبل جمع المناديل ، وفي هذه الحالة قم بلفها في شبه غشاء وتخزينها في 4 درجات مئوية لاستخدامها لاحقا. لا ينصح بالتخزين لمدة تزيد عن 6 ساعات لأن وحدة التحكم في المحرك ستجف.

2. إنشاء ثقافات الأعضاء

ملاحظة: توضح هذه الخطوة كيفية وضع مزارع الأعضاء المتساقطة ومزارع الأعضاء الزغبية في آبار منفصلة. الأنسجة ليست على اتصال. يمكن للباحثين المهتمين بتقنية الثقافة المشتركة حيث تكون الديسيدوا والزغابات على اتصال مباشر مع بعضهما البعض الرجوع إلى الأدبيات السابقة.

1. اشطف العينات مرتين في وسائط التجميع ، وجهاز الطرد المركزي عند 1,000 × جم بين كل شطف. انقل الأنسجة إلى طبق بتري معقم وضعها على مسرح مجهر تشريح. احتفظ بلوحة 6 آبار على الجليد بجوار المجهر.
تشريح
2. الأنسجة الدقيقة باستخدام مقص وملقط معقم لتشريح الزنبرك ، لإنشاء مزارع أعضاء زغابية 2-3 مم (الشكل 1 أ).
   ملاحظه: مزارع الأعضاء الزبدبة عبارة عن "أشجار" صغيرة وجيدة الأوعية الدموية مع 2 أو 3 فروع ، وبها أعمدة خلوية بارزة للأرومة الغاذية (EVT). من المهم استخدام الأنسجة الزغابية فقط من عينات الثلث الأول من الحمل <9 أسابيع ، حيث يكون غزو الأرومات الغاذية خارج الزغابات في ECM أكثر وضوحا في هذه الأعمار المبكرة.
3. حدد الزغابات الوعائية جيدا مع أعمدة خلايا EVT البارزة. يتم تصور أعمدة خلية EVT على أنها نهايات منتفخة ، "غامضة" ، "رقيقة" (راجع رؤوس الأسهم في الشكل 1 أ).
4. استخدم ملقطا معقما لنقل 3 أو 4 أشجار زغبية إلى كل بئر. اضبط الفروع بحيث يتم وضع الشجرة بشكل مسطح فوق ECM وفصل الفروع المتكتلة.
تشريح
5. دقيق للأنسجة المتساقطة باستخدام مقص وملقط معقم لتشريح الزنبرك ، لإنشاء مزارع أعضاء متساوية 3 مم³ (الشكل 1 أ).
   ملاحظه: تحتوي العينات على نوعين متميزين من الأنسجة المتساقطة ، decidua parietalis و decidua capsularis (شظايا الأنسجة اليمنى واليسرى ، على التوالي ، الشكل 1 أ).
6. تقليم بالمقص لإنشاء 3 مم³ قطع من decidua parietalis. لا يستخدم Decidua capsularis لهذه الثقافات. استخدم الملقط لإزالة أي دم أمومي متخثر.
7. استخدم ملقطا معقما لنقل 3-4 قطع من الديسيدوا إلى كل بئر.
8. أضف 1 مل من وسائط التجميع إلى قاع البئر. احتضان اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
9. بالنسبة للتجارب التي يكون فيها من المهم تقليد توتر الأكسجين المشيمي الطبيعي في الثلث الأول من الحمل ، حافظ على مزارع الأعضاء الزغابية في نقص الأكسجة النسبي (3٪ O₂).
   ملاحظه: تشمل خيارات المختبر غرف حاضنة صغيرة لنقص الأكسجة تتناسب مع الحاضنات الحالية أو حاضنة ثلاثية الغازات تقدم غاز N₂ الخارجي لخفض تركيز الأكسجين.
10. أضف 1 مل من الوسط الزبدب أو المقطع (الجدول 1) إلى الجزء العلوي من البئر بعد 12-16 ساعة من الزراعة.
    ملاحظه: يسمح غياب الوسائط خلال الليل الأول في الثقافة لأعمدة الخلايا الأرومة الغاذية الرائعة بالغزو (الثقافة الزغابية) ، ولكي تصبح الأنسجة (الزغابية والمتساقطة) جزءا لا يتجزأ بشكل آمن في ECM. من خلال تجربتنا ، تظل مزارع الأعضاء المتساقطة قابلة للحياة لمدة 72 ساعة ومزارع الأعضاء الزغبية لمدة 96 ساعة. نوصي بنقاط النهاية التجريبية التي تقع ضمن هذا الإطار الزمني. انظر الجدول 1 لمعرفة تكوين الوسط الزغبي والمتساقط يحتوي على نسبة عالية من FBS ، بينما يتم استكمال الوسط الفضي بهرمونات الحمل (البروجسترون ، 17β-استراديول) التي تحافظ على الحالة المتساقطة (الجدول 1).

< p class = "jove_title" >3. تحضير L. monocytogenes الثقافات

< p class = "jove_content" >ملاحظة: للحصول على بروتوكول مفصل حول التخزين طويل الأجل ل L. monocytogenes ، وثقافة ونمو هذا الكائن الحي في مرق وأغار ضخ القلب في الدماغ (BHI) ، يرجى الرجوع إلى Wang et al.

1. اختر مستعمرة L. monocytogenes واحدة من صفيحة أجار BHI مخططة وقم بتلقيح 3 مل من مرق BHI.
2. احتضان L. monocytogenes ثقافة بين عشية وضحاها (16 ساعة) ، في وضع مائل ، عند 30 درجة مئوية
   ملاحظه: تسمح ظروف الثقافة هذه بنمو البكتيريا بالوصول إلى المرحلة الثابتة. L. monocytogenes يتم سوطاها عند 30 درجة مئوية ، مما يزيد من غزو الخلية المضيفة.

< p class = "jove_title" >4. إصابة مزارع الأعضاء ب L. monocytogenes

محلول
1. ملحي دافئ مخزن بالفوسفات (PBS) ووسط زخب أو متساقط (الجدول 1) إلى 37 درجة مئوية.
2. استخدم ملاقط معقمة لإزالة أي قطع مزرعة أعضاء لم تغزو ECM ، وبالتالي تطفو في البئر.
3. استنشق الوسائط بعناية من أسفل البئر. اشطف الآبار العلوية والسفلية مرتين عن طريق سحب 1 مل من PBS الدافئ برفق في البئر ، وشفطها بعناية بينهما. مرر الماصة 1 مل من الوسائط الزبدبة أو الرقيقة الخالية من المضادات الحيوية برفق إلى البئر العلوي والسفلي. احرص على عدم إزعاج ثقافة الأعضاء.
4. دع الأنسجة تحتضن في وسائط خالية من المضادات الحيوية لمدة ساعة على الأقل لضمان إزالة المضادات الحيوية.
   ملاحظه: في المرحلة الثابتة ، تبلغ كثافة L. monocytogenes ثقافة حوالي 1 × 10⁹ وحدات تشكيل مستعمرة (CFU) لكل مل. يجب تحديد عدد البكتيريا المستخدمة لإصابة مزارع الأعضاء تجريبيا لتلبية الاحتياجات التجريبية.
5. بالنسبة للنوع البري L. monocytogenes تظهر تجارب العدوى الروتينية غزوا قويا مع تخفيف 1:50 بين عشية وضحاها (4 × 10⁷ لتر من المستويات في 1 مل من الوسائط لكل بئر). أعد تعليق العدد المناسب من البكتيريا في وسط زبدب أو نفضي خال من المضادات الحيوية.
6. استنشق الوسائط من أعلى الآبار. أضف برفق 1 مل من اللقاح. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ للسماح بالغزو البكتيري.
7. قم بإزالة البكتيريا خارج الخلية عن طريق شفط الوسائط من الآبار العلوية والسفلية. اشطف الآبار مرتين باستخدام PBS الدافئ. أضف 1 مل من الوسائط الزببة أو الديسيجوال مع 50 ميكروغرام ^{مل -1} جنتاميسين. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
   ملاحظة: L. monocytogenes هي بكتيريا اختيارية داخل الخلايا يمكن أن تنمو في وسط خارج الخلية ، وتنمو داخل الخلايا ، وتنتشر من خلية إلى أخرى دون الوصول إلى الفضاء خارج الخلية. الجنتاميسين له تأثير مبيد للجراثيم على L. monocytogenes خارج الخلية ، وبالتالي يسمح بقياس نمو L. monocytogenes داخل الخلايا وانتشاره عبر ثقافة الأعضاء.
   ملاحظه: تحدث عدوى L. monocytogenes القابلة للتكرار لمزارع الأعضاء الزغابية والديسيدوا مع أوقات حضانة لمدة 5 ساعات. يمكن تعديل وقت الحضانة قبل إضافة الجنتاميسين بناء على الاحتياجات التجريبية وقدرة الكائن الحي على غزو الأنسجة. لفهم المواقع التشريحية الأكثر عرضة للعدوى بشكل أفضل ، يمكن استخدام أوقات حضانة أقصر.
8. حافظ على الألواح عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} طوال مدة التجربة. قم بتغيير الوسائط بأكملها في كل بئر يوميا.
   ملاحظه: في تجربتنا ، تظل مزارع الأعضاء المتساقطة المصابة ب L. monocytogenes قابلة للحياة لمدة 48 ساعة ومزارع الأعضاء الزغبية لمدة 72 ساعة.

الجدول 1: وصفات الوسائط. مكونات وتركيزات لتحضير المخزن المؤقت للغسيل ، ووسط التجميع ، والوسط الزخب ، والوسط المتقطع

عازلة الغسيل وسط التجميع وسط زبلب متوسط ديسيوئل برنامج تلفزيوني DMEM / F-12 مع GlutaMAX DMEM / F-12 مع GlutaMAX DMEM / F-12 مع GlutaMAX البنسلين 100 وحدة دولية / مل مصل الأجنة البقري 2.5٪ مصل الأبقار الجنين 20٪ مصل الأجنة البقري 2.5٪ ستربتومايسين 100 ميكروغرام / مل البنسلين 100 وحدة دولية / مل البنسلين 100 وحدة دولية / مل 17β-استراديول 300 بيكوغرام / مل جنتاميسين 50 ميكروغرام / مل ستربتومايسين 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين 100 ميكروغرام / مل البروجسترون 20 نانوغرام / مل أمفوتريسين ب 1.25 ميكروغرام / مل جنتاميسين 50 ميكروغرام / مل أمفوتريسين ب 1.25 ميكروغرام / مل

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: مزارع الأعضاء الزبدبة - صور إجمالية ومجهرية تمثيلية.

(A) شجرتان زغابتان طرفيتان يبلغ عمرهما الحملي 6 أسابيع ، كما ينظر إليها تحت المجهر التشريح. لاحظ النهايات "الرقيقة" (رؤوس الأسهم) والأوعية الدموية الجنينية البارزة التي تمر عبر أغصان الشجرة على اليسار مما يجعل هذه القطعة مناسبة لثقافة الأعضاء. (ب) ال...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أكياس التعقيم فيشر ساينتيك 01-812-54 لتعقيم أدوات التشريح الفردية مصفاة شبكية دقيقة كويزينارت (Amazon.com) غير أ لفها بالكامل بورق الألمنيوم والأوتوكلاف قبل جمع الأنسجة. كاربوي مع حنفية فيشر ساينتيك 03-007-647 لإعداد كميات كبيرة من المخزن المؤقت للغسيل. أكياس الثلج مختبرات نورتك جيجابايت8818 لا يلزم شراؤها ، بل يمكن إعادة تدويرها / إعادة استخدامها من أي شحنة معملية روتينية تدرجها في العبوة. 70٪ إيثانول VWR V1001 70٪ محلول مصنوع عن طريق إضافة dH20 إلى 190 أو 200 دليل على الكحول من الدرجة البحثية. 10٪ مبيض شمعة التوريد الصحي CLO 30966 حل 10٪ مصنوع عن طريق إضافة dH20. صندوق الضوء لايت بوكس لومينا (dickblick.com) 55305-2009 ملاحظة المصابيح البديلة التي تم شراؤها أيضا على Blick (55305.0100) ملقط تشريح دقيق ستويلتينج 52102-43 4 بوصة ، 1 × 2 0.5 مم ، منحنى طفيف ملقط تشريح دقيق ستويلتينج 52102-06 4 بوصة ، مستقيم ناعم ، حاد مقص زنبركي التشريح الدقيق ستويلتينج 52130-01 ف ماكفرسون فاناس مقص زنبركي، 8.5 سم، 0.33 طرف، منحنى طفيف تشريح المجهر لايكا مايكروسيستمز MZ16 أو M60 لقد حققنا نجاحا مع النماذج المدرجة. مصادر الضوء المرنة الخارجية ذات الرأس المنحنية مفيدة ولكنها ليست ضرورية. 50 مل أنابيب مخروطية سيجما ألدريتش (كورنينج) CLS4558 محلول ملحي مخزن بالفوسفات جيبكو (ثيرموفيشر العلمي) 10010023 نشتري من منشأة ثقافة الأنسجة الأساسية بجامعتنا ، تتوفر خيارات بديلة مثل هذه. 10X فوسفات محلول ملحي مخزن تكنوفا P0195 لإعداد المخزن المؤقت للغسيل نستخدم 10X PBS خليط المغذيات DMEM / F-12 (لحم الخنزير) مع GlutaMAX جيبكو (تقنيات الحياة) هاتف: 10565-018 نشتري تركيبة الوسائط المحددة هذه ، والتي تحتوي على 2.438 جم / لتر بيكربونات الصوديوم ، و 55 مجم / لتر من بيروفات الصوديوم ، و 4.5 جم / لتر من الجلوكوز الجنتاميسين ثيرموفيشر العلمي 15710072 مخزون 1000X. نوصي بتحضير وتخزين الحصص عند -20 درجة مئوية لتجنب التجميد / الذوبان. البنسلين / الستربتومايسين جيبكو (ثيرموفيشر العلمي) 15140-122 مخزون 100X. نوصي بتحضير وتخزين الحصص عند -20 درجة مئوية لتجنب التجميد / الذوبان. الأمفوتريسين ب جيبكو (ثيرموفيشر العلمي) 15290-018 مخزون 500X. نوصي بتحضير وتخزين الحصص عند -20 درجة مئوية لتجنب التجميد / الذوبان. البروجسترون سيجما ألدريتش ص 8783 يتم تصنيع محلول مخزون 1 ملي مولار عن طريق إعادة تكوين 15.7 مجم من مسحوق البروجسترون في 15.7 مل من الإيثانول وإضافة 34.3 مل من PBS. يتم ترشيح المحلول معقم وتخزينه عند -20 درجة مئوية. 17β-استراديول سيجما ألدريتش E2758 يتم تصنيع محلول مخزون 10 ميكرومتر عن طريق إعادة تكوين 13.5 مجم من مسحوق الاستراديول في 10 مل من الإيثانول وإضافة 40 مل من PBS. يتم ترشيح المحلول معقم وتخزينه عند -20 درجة مئوية. مرشح الفراغ العلوي للزجاجة (0.22 ميكرومتر) سيجما ألدريتش (كورنينج) CLS430769 للترشيح المعقم لوسائط التجميع بعد التحضير لوحة ثقافة الأنسجة 6 آبار بي دي فالكون 353224 البوليسترين ، زراعة الأنسجة المعالجة 6-آبار الآبار ميليبور PICM03050 إدراج - قطر 30 مم ، غشاء PTFE محب للماء بحجم 0.4 ميكرومتر المصفوفة خارج الخلية (على سبيل المثال ، ماتريكيل ماتريكل) BD Biosciences 354234 لقد استخدمنا Matrigel Matrix في دراساتنا. إنه مادة صلبة في درجة حرارة الغرفة وعند -20 درجة مئوية. تجنب تكرار التجميد / الذوبان. قم بإذابة الزجاجة إلى محلول لزج عند 4 درجات مئوية ، وقم بإعداد ~ 300 ميكرولتر في الغرفة الباردة بأطراف ماصة مبردة. قم بتخزين الحصص عند -20 درجة مئوية. بارافورمالدهايد ، 16٪ وزن / حجم محلول مائي ألفا إيسار 30525-89-4 لتثبيت الأنسجة ، يتم تحضير 4٪ بارافورمالدهيد عن طريق تخفيف هذا المخزون في PBS. حاضنة زراعة الأنسجة ، يتم الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ ، 3٪ أكسجين (اختياري لمزارع الأعضاء الزغابية) بالنسبة لبعض التجارب، قد يفضل نقص الأكسجة. يمكن تحديد ذلك بطرق متعددة ، بما في ذلك إضافة النيتروجين الخارجي عبر أسطوانة الغاز وأنابيب Tygon والمنظم. جهاز طرد مركزي أعلى مقاعد البدلاء