توليد نموذج لزراعة الخلايا في المختبر للعدوى المشتركة بين الملاريا وفيروس العوز المناعي البشري

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Finney، C. et al.، نموذج في المختبر لقياس الاستجابات المناعية للملاريا في سياق العدوى المشتركة لفيروس نقص المناعة البشرية.J. Vis. Exp.(2015)

يوضح هذا الفيديو توليد نموذج زراعة خلايا العدوى المشتركة للملاريا وفيروس نقص المناعة البشرية في المختبر. من المحتمل أن تدعم خلايا الدم المحيطية أحادية النواة المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية المزروعة بالاشتراك مع كريات الدم الحمراء المتطفلة المتصورة نمو بعضها البعض وتوفر رؤى حول الاستجابات المناعية وتطور المرض في العدوى المشتركة لفيروس نقص المناعة البشرية والملاريا.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

CAUTION: يتطلب العمل مع عينات الدم البشري وطفيليات الملاريا البشرية تدابير احترازية. ارتد دائما معطف المختبر والقفازات واعمل في خزانة السلامة الحيوية من المستوى 2. في حالة التعرض العرضي للملاريا البشرية عن طريق الجلد، يجب إبلاغ الصحة والسلامة للعلاج الوقائي. وينبغي أيضا وضع اعتبارات إضافية تتعلق بالسلامة للعمل مع فيروس العوز المناعي البشري وفيروس العوز المناعي البشري (+) في الدم. ارتد معطف مختبر يغلق من الخلف. قفاز مزدوج (يجب أن يكون القفاز العلوي من اللاتكس). قم بإجراء جميع المناولة في خزانة السلامة البيولوجية من المستوى 2. لا تستخدم أي زجاج أو أشياء حادة. لا تستخدم شفاطة. ضع جميع العناصر الملوثة في محلول فيروكس أو مبيض لمدة 1 ساعة على الأقل قبل التخلص منها. اغسل جميع الأسطح بالفيروكس والأشعة فوق البنفسجية (UV) لمدة 1 ساعة بعد الاستخدام. لاحظ أن كل مؤسسة سيكون لها لوائح السلامة البيولوجية الخاصة بها والتي يجب اتباعها. أبلغ الصحة والسلامة عن جميع حالات التعرض العرضي للدم المصاب بفيروس العوز المناعي البشري لتقييمه والنظر في الوقاية الممكنة بعد التعرض.

ملاحظة: توجد سلالات مختلفة من طفيليات الملاريا المنجلية. تم استخدام ITG في هذه التجارب ، ولكن يمكن استخدام سلالات مختلفة. تتوفر تعليمات ممتازة حول تجميد وذوبان طفيليات المتصورة المنجلية على موقع MR4.

< p class = "jove_title" >1. صنع RPMI-A لزراعة طفيليات الملاريا

1. اصنع RPMI-0 عن طريق خلط 950 مل من الماء المقطر المزدوج (ddH₂O) ، وعلبة واحدة من مسحوق معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) -1640 ، و 6 جم من N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) ، و 2 جم من بيكربونات الصوديوم ، و 1.35 مجم من هيبوكسانثين.
2. قم بإذابة المصل البشري المعطل بالحرارة من متبرعين مختلفين. المتبرعون ب AB هم الأفضل ولكن يمكن استخدام أي منها إذا نمت الطفيليات في خلايا الدم الحمراء من النوع O (RBC). اقلب الأنابيب للخلط. إذا كان المصل يحتوي على جسيمات أو كان سميكا يدور عند 2,000 دورة في الدقيقة ثم قم بتصفية الجزء السائل باستخدام وحدة تصفية 0.45 ميكرومتر.
3. باستخدام مرشح وحدة مرشح 0.2 ميكرومتر ، 180 مل من RPMI-0 ، و 20 مل من المصل البشري (10 مل من كل متبرع) ، و 0.5 مل من 10 مجم / مل من الجنتاميسين.
   ملاحظه: يمكن للمصل البشري أن يسد المرشح ، لذا قد تكون هناك حاجة إلى أكثر من وحدة مرشح واحدة.
4. قم بتسمية الزجاجة المتوسطة ب RPMI-A والتاريخ ومصدر المصل. برد لحين الحاجة. قد يتحول RPMI-A إلى غائم عند تبريده. هذا أمر طبيعي ، لكن زيادة الغيوم هي علامة على التلوث.
   ملاحظه: قد يختلف نمو الطفيليات في أمصال المتبرعين المختلفة. من الجيد اختبار جميع دفعات المصل البشري لنمو الطفيليات الجيد قبل الاستخدام.

2. تحضير خلايا الدم الحمراء البشرية لزراعة الطفيليات

ملاحظة: يجب أن يكون المتبرعون بالدم من النوع O.

1. اجمع 7-10 مل من الدم في أنابيب حمض السترات وسكر العنب (ACD). اكتب هوية المتبرع وتاريخ الاستلام على الملصق.
2. قم بتخزين الدم في درجة حرارة 4 ^درجاتمئوية لحين الحاجة. استخدم الدم لزراعة الطفيليات في غضون 1 شهر.
3. امسح الجزء العلوي من الأنبوب بنسبة 70٪ من الإيثانول. قم بإزالة السدادة بعناية وتخلص منها. نقل الدم إلى أنبوب سعة 15 مل. تدور لمدة 3 دقائق عند 1,000 × جم. إزالة البلازما عن طريق الشفط.
4. قم بتعليق كرات الدم الحمراء بحجم متساو من RPMI-0 الدافئ. تدور لمدة 5 دقائق عند 1,000 × جم. قم بإزالة الطبقة المصنوعة من الورق عن طريق الشفط ، وأعد تعليقها في 5 مل من RPMI-0 ، وكرر الغسيل مرتين أخريين.
5. قم بإزالة المادة الطافية وأضف ما يكفي من RPMI-A لإنتاج خليط يحتوي على 50٪ كرات الدم الحمراء من حيث الحجم.
6. يحفظ في درجة حرارة 4 ^درجاتمئوية لحين الحاجة.

< p class = "jove_title" >3. الحفاظ على ثقافات الطفيليات

1. قبل تسخين RPMI-A إلى 37 ^درجةمئوية.
2. ضع الطفيليات المذابة (انظر بروتوكول MR4 لإجراء الذوبان) في قارورة T25 مع 5 مل من RPMI-A و 75 ميكرولتر من كرات الدم الحمراء البشرية المغسولة للحصول على هيماتوكريت ~ 3٪. ملاحظه: يقيس الهيماتوكريت حجم كرات الدم الحمراء مقارنة بالحجم الإجمالي. لحساب الهيماتوكريت ، قم بقياس حجم كرات الدم الحمراء المعبأة إلى الحجم الإجمالي للمتوسط بالإضافة إلى كرات الدم الحمراء. افترض أن الطفيليات المذابة ستساهم ب 75 ميكرولتر من كرات الدم الحمراء. بإضافة 150 ميكرولتر من مخزون كرات الدم الحمراء (وهو ما يعادل إضافة 75 ميكرولتر من كرات الدم الحمراء المعبأة) إلى القارورة ، يكون هناك ما مجموعه 150 ميكرولتر من كرات الدم الحمراء في 5 مل من الوسط ، وهو ما يعادل الهيماتوكريت 3٪ (150 ميكرولتر / 5,000 ميكرولتر × 100٪ = 3٪).
3. قم بغاز القارورة لمدة 30 ثانية بخليط غاز الطفيليات (1٪ O₂ ، 3٪ CO₂ ، التوازن N₂). أغلق القارورة وضعها على الجانب العريض لأسفل في حاضنة 37 ^{درجة مئوية}للسماح بأكبر مساحة سطح لتبادل الغازات.
4. لتغيير الوسط والتحقق من وجود طفيليات (يجب القيام به يوميا) ، حرك القارورة بعناية حتى لا تزعج طبقة كرات الدم الحمراء. باستخدام ماصة باستور معقمة غير متصلة بالكهرباء ، اسحب وسط المزرعة دون إزعاج طبقة الدم.
5. للتحقق من تطفل الدم ، قم بإزالة عينة سعة 10 ميكرولتر من طبقة الدم ، وضعها على شريحة زجاجية ، وباستخدام شريحة زجاجية ثانية ، قم بإنشاء طبقة دموية رقيقة. دع الشريحة تجف.
6. ضع 4 مل من RPMI-A الطازج في القارورة ، واخلطها برفق ، والغاز لمدة 30 ثانية ، وضعها في حاضنة عند 37 درجة مئوية.
7. قم بتلطيخ الشريحة باستخدام مجموعة تلطيخ Hema3 وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
   1. للحصول على تلطيخ مثالي، اغمس الشرائح في محلول التثبيت لمدة 10 ثوان، والمحلول الأول لمدة 10 ثوان، والمحلول الثاني لمدة 30 ثانية. اشطفها بالماء واترك الشرائح حتى تجف.
8. احسب الطفيليات عن طريق حساب عدد كرات الدم الحمراء المتصورة المنجلية ، PfRBC (الأرجواني الداكن الملون) مقابل العدد الإجمالي لكرات الدم الحمراء (اللون الوردي الملون). عد ما مجموعه 300 خلية لضمان الدقة.
9. عندما تصل الطفيليات إلى طفيليات بنسبة 5٪ ، قم بتوسيع الثقافة إلى قارورة T75 ، باستخدام 40 مل من RPMI-A ، و 500 ميكرولتر من كرات الدم الحمراء.

< p class = "jove_title" >4. مزامنة الطفيليات

ملاحظة: في اليوم السابق للتجربة ، قم بمزامنة مزرعة الطفيليات عن طريق معالجتها بالألانين. فقط طفيليات المرحلة الحلقية وكرات الدم الحمراء غير المصابة ستنجو من هذا العلاج. ستمنحك مزامنة الألانين ثقافة تروفوزويت نقية في اليوم التالي يمكن استخدامها في تجارب الزراعة المشتركة. تأكد من البدء بثقافة الطفيليات التي تحتوي على غالبية الطفيليات في المرحلة الحلقية.

1. تحضير محلول ألانين عن طريق خلط 8.01 جم من الألانين (300 ملم) و 0.365 جم من تريس (10 مل) في 300 مل من ddH₂O. ارفع الرقم الهيدروجيني إلى 7.4. تعقيم الفلتر باستخدام وحدة تصفية 0.2 ميكرومتر.
2. قم بتسخين محلول الألانين مسبقا إلى 37 ^درجةمئوية.
3. قم بتدوير ثقافة الطفيليات (5 دقائق × 1,000 × جم) ، وقم بإزالة الوسط.
4. أعد تعليق الحبيبات في 19 مجلدا من محلول ألانين (1 مل معبأ من كرات الدم الحمراء إلى 19 مل محلول ألانين). احتضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
5. تدور 5 دقائق × 1,000 × ز. طافي الشفط. يغسل في RPMI-0 مرة واحدة. قم بالشفط الطافي وإعادة التعليق في RPMI-A وضبط الهيماتوكريت على ~ 3٪. قارورة غاز والعودة إلى 37 ^درجةمئوية
   ملاحظه: بالنسبة لتجارب الاستزراع المشترك ، هناك حاجة إلى حد أدنى من الطفيليات بنسبة 5٪ من التروفوزويت ، مع اعتبار 10٪ طفيليات مثالية.

< p class = "jove_title" >5. تحضير الطفيليات وكرات الدم الحمراء لتجارب الزراعة المشتركة

1. استخدم نسبة 3 PfRBC لكل PBMC في تجارب الزراعة المشتركة للحث على استجابة التهابية. لحساب إجمالي كرات الدم PfRBC ، حدد كمية الطفيليات عن طريق عمل مسحة دم رقيقة كما هو موضح في 3.5 ، والهيماتوكريت عن طريق حساب عدد كرات الدم الحمراء لكل مل من زراعة الطفيليات باستخدام مقياس الدم.
   عدد كرات الدم الكريهة الحمراء = ٪ طفيليات × إجمالي كرات الدم الحمراء / مل × مل من المزرعة. على سبيل المثال ، 10 مل من المزرعة عند 10 × 10⁶ كرات الدم الحمراء / مل و 10٪ طفيليات تساوي 0.1 × 10⁶ / مل × 10 مل = 10 × 10⁶ PfRBC.
2. قم بتدوير مزرعة الطفيليات لمدة 5 دقائق عند 1,000 × جم (RT). استنشق متوسطا ، وأعد تعليقه عند 6 × 10⁶ PfRBC لكل مل في RPMI-S + (500 مل RPMI-1640 مكمل ب L-glutamine و HEPES ، 10٪ مصل بقري جنيني معطل بالحرارة (FBS) ، 1.5 مل جنتاميسين ، 5 مل من 100 ملي بيروفات الصوديوم ، 5 مل من الأحماض الأمينية غير الأساسية 10 ملي MEM ، 5 مل من 5 ملي مولار β-ميركابتو إيثانول).
3. السيطرة على الدم (كرات الدم الحمراء غير المصابة من نفس المتبرع المستخدم للحفاظ على ثقافة الطفيليات) ، وحساب الهيماتوكريت ، وإعادة التعليق في RPMI-S + بنفس عدد كرات الدم الحمراء لكل مل مثل مزرعة الطفيليات.

< p class = "jove_title" >6. عزل خلايا الدم المحيطي البشرية أحادية النواة (PBMC)

1. جمع الدم الوريدي في أنابيب هيبارين الصوديوم (القمة الخضراء) من كل من متبرع مزمن بفيروس العوز المناعي البشري(+) وضابط مكافحة فيروس العوز المناعي البشري (-). لا تستخدم حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) كمضاد للتخثر لأن تأثير مخلب الكالسيوم في EDTA يؤثر على وظيفة الخلية. في المتوسط توقع ما بين 5-10 × 10⁶ PBMC لكل 10 مل من الدم. لتجربة نموذجية ، اجمع 30 مل من الدم من كل متبرع. يجب تعديل حجم الدم وفقا للمتطلبات التجريبية.
في
2. أسرع وقت ممكن وبالتأكيد في غضون ساعة من جمع الدم ، قم بإزالة الدم من الأنابيب ووضعه في أنبوب بلاستيكي سعة 50 مل. سيتم تنشيط الخلايا الوحيدة على وجه الخصوص والالتصاق بالزجاج ، لذلك من المهم في حالة استخدام أنابيب جمع الدم الزجاجية ، تتم إزالة الخلايا في أسرع وقت ممكن.
3. قم بتدوير الدم عند 1000 × جم لمدة 15 دقيقة واجمع البلازما (يمكن استخدام هذا في دراسات أخرى إذا لزم الأمر - إذا لم يكن الأمر كذلك ، فيمكن تخطي هذه الخطوة). خفف الدم بكمية متساوية من محلول ملحي دولبيكو البارد المخزن بالفوسفات (DPBS).
4. ضع 15 مل من RT Ficoll في أنبوب سعة 50 مل. ببطء ، باستخدام ماصة نقل بلاستيكية معقمة ، ضع طبقة من محلول الدم / DPBS فوق Ficoll دون أي خلط. يمكن وضع 25 مل كحد أقصى من محلول الدم / DPBS فوق كل 15 مل من Ficoll.
5. قم بتدوير التدرجات لمدة 30 دقيقة عند RT عند 600 × جم. تأكد من تشغيل إعداد "عدم وجود فرامل".
6. بمجرد دوران الخلايا ، ابحث عن الواجهة بين المرحلتين. هذا هو المكان الذي توجد فيه PBMCs. باستخدام ماصة نقل بلاستيكية معقمة ، اجمع PBMC من الواجهة (انظر الشكل 1). تقليل التلوث بكرات الدم الحمراء.
7. ضع الخلايا المجمعة في أنابيب سعة 50 مل ، مع ما لا يزيد عن 20 مل لكل أنبوب. أنبوب علوي يصل إلى 50 مل مع DPBS بارد معقم.
8. قم بتدوير الخلايا لمدة 10 دقائق عند 4 ^درجاتمئوية عند 300 × جم.
9. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 5 مل DPBS بارد معقم ، وقم بتجميع جميع الخلايا من نفس المتبرع في أنبوب واحد. قم بتعبئة ما يصل إلى 50 مل باستخدام DPBS معقم ، وكرر خطوات الغسيل مرتين أخريين.
10. أعد تعليق الخلايا في وسط 10 مل RPMI-S +.
11. قم بإزالة 20 ميكرولتر من الكمية واخلطها مع 20 ميكرولتر من التريبان الأزرق. الماصة 10 ميكرولتر في مقياس الدم وحساب الخلايا الحية (الخلايا التي لم تتناول الصبغة الزرقاء - جميع الخلايا الزرقاء ميتة). استخدم مقياس كثافة الدم لحساب رقم الخلية في محلول على النحو التالي. < / > ملاحظه: يحتوي مقياس الدم على شبكة ذات أبعاد محددة بحيث تكون المنطقة التي تغطيها الخطوط معروفة.
    1. تأكد من نظافة مقياس كثافة الدم. ضع الغطاء فوق منطقة العد. قم بتحميل 10 ميكرولتر من محلول الخلية عن طريق وضع طرف الماصة في أحد الآبار على شكل حرف V. سيتم ملء المنطقة الموجودة أسفل الغطاء بعمل شعري.
    2. ضع مقياس الدم المحمل تحت المجهر. تحتوي الشبكة الكاملة لمقياس الدم على 9 مربعات بحجم 1 مم² لكل منها. عد جميع الخلايا داخل كل مربع كبير. في حالة وجود عدد كبير جدا من الخلايا ، قم بتخفيف المحلول أكثر وإعادة العد.
    3. احسب تركيز الخلية على النحو التالي: إجمالي الخلايا / مل = (إجمالي الخلايا التي تم عدها / # المربعات) × عامل التخفيف × 10,000 خلية / مل ، على سبيل المثال ، (500 خلية / 5 مربعات) × عامل التخفيف 20 × 10,000 خلية / مل = 20 × 10⁶ خلايا إجمالا.
12. اضبط الوسط على تركيز نهائي 10 × 10⁶ لكل مل (وسيط RPMI-S +).

< p class = "jove_title" >7. ثقافة العدوى المشتركة بين الملاريا وفيروس العوز المناعي البشري

1. صفيحة 100 ميكرولتر من PBMCs المعزولة و 400 ميكرولتر من RPMI-S + متوسط إلى صفيحة 24 بئرا (1 × 10⁶ PBMC لكل بئر). تأكد من إنشاء الآبار في ثلاث نسخ: 3 آبار لكرات الدم الحمراء غير المصابة ، و 3 آبار مع PfRBC ، و 3 آبار متوسطة ، و 3 آبار مع PMA / Ionomycin. هذا لكل من عينات فيروس نقص المناعة البشرية (+) و HIV (-).
2. بالنسبة لآبار PfRBC ، ضع 3 × 10⁶ PfRBC في كل من الآبار (500 ميكرولتر من زراعة الطفيليات المحضرة في 5.2).
3. بالنسبة لآبار كرات الدم الحمراء غير المصابة ، ضع 500 ميكرولتر من مزرعة كرات الدم الحمراء غير المصابة المحضرة في 5.3 في كل بئر.
4. بالنسبة للآبار المتوسطة ، ضع 500 ميكرولتر من وسط RPMI-S + في كل بئر.
5. بالنسبة لآبار PMA / Ionomycin ، قم بإعداد محلول PMA / Ionomycin (2.5 بيكوغرام / مل ، 250 بيكوغرام / مل على التوالي). ضع 500 ميكرولتر من هذا المحلول في كل بئر.
   ملاحظه: كمنشطات قوية لإفراز السيتوكين في الخلايا التائية ، يتم استخدام PMA و Ionomycin كضوابط إيجابية لضمان عمل الخلايا.
6. ضع اللوحة على حرارة 37 ^درجةمئوية في حاضنة 5٪ CO₂.
7. اختياري: استخدم الخلايا الزائدة لتحليل النمط الظاهري باستخدام قياس التدفق الخلوي أو قم بتخزينها في محلول تثبيت الحمض النووي الريبي لتحليل تعبير الرنا المرسال في المستقبل.

< p class = "jove_title" >8. الكشف عن الاستجابات المناعية للملاريا

ملاحظة: قم بإجراء تجارب الزراعة المشتركة لمدة تصل إلى 4 أيام. لا يلزم تغيير متوسط خلال هذا الوقت. ستعتمد النقطة الزمنية المثلى على نوع الخلية التي تهمك والسؤال المطروح. تعتبر الحضانة لمدة 12-48 ساعة مثالية للاستجابات أحادية الخلية لكرات الدم PfRBCs ، بينما لوحظت استجابات الخلايا الليمفاوية بشكل أفضل في 72-96 ساعة. يجب تحسين النقاط الزمنية بناء على السؤال التجريبي. يمكن استخدام فترات أقصر (2-4 ساعات) إذا كان التفاعل بين PfRBCs السليمة و PBMCs ذا أهمية.

1. تدور الصفيحة عند 300 × جم لمدة 3 دقائق لخلايا الحبيبات. اجمع 700 ميكرولتر من المادة الطافية من كل بئر.
2. قم بتدوير المادة الطافية عند 1,000 × جم لمدة 5 دقائق لإزالة أي حطام.
يتم
3. إزالة Aliquot من المادة الطافية حسب الحاجة ، والتسمية ، والتجميد عند أقل من -20 درجة مئوية حتى يتم إجراء تحليل العوامل المفرزة.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. تصوير تدرج Ficoll بعد الدوران يوضح موقع PBMCs.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ألانين سيغما أ 7377 BD Vacutainer ACD الحل A دينار بحريني 364506 BD Vacutainer الصوديوم هيبارين دينار بحريني 17-1440-02 DPBS (بدون كالسيوم ، بدون مغنيسيوم) كورنينج 21-031-السيرة الذاتية مصل الأبقار الجنينية سيغما F1051 تعطيل الحرارة قبل الاستخدام فيكول باك بلس جنرال إلكتريك للرعاية الصحية 17-1440-02 جنتاميسين (10 مجم / مل) جيبكو 15710-064 مجموعة تلطيخ Hema3 صياد 122-911 هيبس صياد BP310-500 هيبوكسانثين سيغما H9636 الأيونومايسين سيغما I3909 الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM (10 ملم) جيبكو 11140 سلطة النقد الفلسطينية سيغما ص 8139 مسحوق RPMI-1640 تقنيات الحياة 31800-022 RPMI-1640 مع L-glutamine و HEPES الترمو: العلمية SH30255.01 بيكربونات الصوديوم (مسحوق ، زراعة الخلايا) سيغما الطراز S5761 بيروفات الصوديوم (100 ملم) جيبكو هاتف: 11360 تريس (قاعدة تريزما ) سيغما تي 6066 تريزول أمبيون 15596018 تريبان بلو (0.4٪) جيبكو 15250-061 خليط غاز الطفيليات بأمر خاص 3٪ CO2 ، 1٪ O2 ، التوازن N2