تحريض مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف في نماذج الفئران عن طريق زرع نخاع العظم الخيفي وخلايا الطحال

الملخص

المصدر: Buchele, V., et al. تحريض مرض الكسب غير المشروع المعوي مقابل المضيف وتقييمه بالمنظار المصغر في الفئران الحية. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو تحريض مرض الكسب غير المشروع المعوي مقابل المضيف ، GvHD ، في فأر متلقي مميت للإشعاع باستخدام الخلايا الجذعية المكونة للدم الخيفي والخلايا الليمفاوية التائية الحساسة للطحال المحفزة ل GvHD. يساعد هذا البروتوكول في إنشاء نموذج GvHD معوي حاد وخيمة لفهم آلية المرض وتطوير خيارات علاجية مبتكرة.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

فئة

1. تحريض GvHD

1. اليوم 0: تشعيع الجسم الكلي للفئران المتلقية
   1. استخدم إناث الفئران CD45.2 + H2kd + BALB / c التي لا يقل عمرها عن 10 أسابيع كمتلقين.
   2. قم بوزن وتسجيل وزن الفئران المتلقية قبل تحريض GvHD.
      ملاحظه: تأكد من أن المتلقي لديه وزن جسم لا يقل عن 20 جراما. سيكون وزن الجسم الأولي بمثابة القيمة المرجعية لحساب فقدان الوزن للفأرة الفردية على مدار تحريض GvHD وتقدمه.
   3. ضع ما يصل إلى خمسة فئران في حاوية مشعاع الأشعة السينية.
   4. تشعيع الفئران عن طريق تشعيع الجسم بالكامل بجرعة واحدة من 8 غراي من الأشعة السينية. استخدم Cs137 كمصدر للإشعاع.
2. اليوم 1: إعادة تكوين الفئران المشععة بنخاع العظام المستنفد من الخلايا التائية
   ملاحظه: يجب أن تتم عملية زرع خلايا نخاع العظم الخيفية ، كما هو موضح ومفصل في القسم 1.2 ، في غضون 24 ساعة بعد التشعيع. قم بتنفيذ الإجراءات الموضحة أدناه في غطاء مزرعة الأنسجة المعقم واستخدم الكواشف المفلترة. استخدم CD45.1 / Ly5.1 B6 الخيفي. الفئران SJL-Ptprca Pepcb / BoyCrl كمتبرعين لنخاع العظام المستنفد من الخلايا التائية.
   1. القتل الرحيم CD45.1 / Ly5.1 B6. الفئران SJL التي ستتبرع بخلايا نخاع العظم الخيفية وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية ، بعد 12-24 ساعة من تشعيع الفئران المتلقية BALB / c. لهذا الغرض ، قم بتخدير CD45.1 / Ly5.1 B6. الفئران SJL عن طريق استنشاق 5٪ إيزوفلوران. استمر في التعرض للأيزوفلوران بعد 1 دقيقة من توقف التنفس وتأكد من القتل الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم.
   2. تطهير فراء وجلد الفأر جيدا باستخدام 70٪ من الإيثانول.
   3. ضع الماوس على غمد عمل نظيف بحيث يكون الفأر في وضع الانبطاح ، مع مواجهة مؤخرته للمجرب. ارفع الفراء عند كعب أخيل بطرف ملقط سيمكين بطول 13 سم وأطراف منحنية مسننة. شق الجلد بين الملقط والكعب بمقص ناعم مقوى مقاس 8.5 سم بأطراف مستقيمة.
   4. قم بإطالة الشق في الجمجمة (أي من الكعب فوق أسفل الساق والفخذ إلى منطقة الورك). قم بإزالة الجلد والفراء من الطرف الخلفي بمساعدة الملقط.
   5. قم بنفس الإجراء على الطرف الخلفي الآخر.
   6. قم بإزالة الأطراف الخلفية عن طريق قطع مفاصل الورك المجاورة.
   7. قطع الكفوف الخلفية. قطع من خلال مفصل الركبة. قم بتخزين الفخذ والساق من كل طرف خلفي معا في طبق بتري مقاس 92 مم مملوء بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) على الثلج.
   8. نظف عظم الفخذ وعظام الساق بعناية عن طريق إزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة العضلية من كل فخذ وساق. انقل عظم الفخذ وعظام الساق إلى أنبوب سعة 50 مل مملوء بوسط RPMI 1640 المعقم وضعه على ثلج مبلل حتى يتم تنظيف جميع عظام الساق وعظم الفخذ التي تم جمعها في الخطوة 1.2.7 من الأنسجة العضلية.
   9. لعزل نخاع العظام ، انقل عظم الفخذ أو عظم الساق في كل مرة (والذي تم تنظيفه كما هو موضح في الخطوة 1.2.8) من أنبوب 50 مل إلى طبق بتري (بقطر 92 مم) مملوء بوسط RPMI 1640. اقطع نهايات عظم الفخذ أو الساق بمشرط للوصول إلى تجويف العظم الذي يحتوي على نخاع العظام.
   10. قم بإعداد أنبوب تجميع سعة 50 مل مع 5 مل من وسط RPMI 1640. أدخل إبرة 26 جم متصلة بحقنة سعة 1 مل مملوءة ب 1 مل من وسط RPMI 1640 في تجويف العظام وقم بإخراج نخاع العظم من التجويف إلى أنبوب التجميع عن طريق دفع المكبس.
   11. كرر الخطوة 1.2.10 حتى يظهر العظم خفيفا ولامعا (أي أن تجويف العظام يخلو بشكل واضح من نخاع العظم المحمر). تخلص من العظم الفارغ.
   12. كرر الخطوات 1.2.9 - 1.2.11 ، باستخدام جميع عظام عظم الفخذ والساق من الخطوة 1.2.8 ، واجمع جميع قطع نخاع العظم المستردة في نفس أنبوب التجميع سعة 50 مل من الخطوة 1.2.10. احتفظ بأنبوب التجميع على الثلج الرطب حتى تتم معالجة جميع العظام من الخطوة 1.2.8 وفقا لذلك.
   13. قم بإنشاء تعليق أحادي الخلية عن طريق سحب قطع نخاع العظم المتدفقة والمتفتتة برفق لأعلى ولأسفل. قم بتصفية معلق نخاع العظم أحادي الخلية من خلال مصفاة خلية غربال شبكية 40 ميكرومتر موضوعة على أنبوب تجميع جديد سعة 50 مل.
   14. جهاز طرد مركزي ، أنبوب التجميع سعة 50 مل ، الذي يحتوي على معلق نخاع العظم أحادي الخلية عند 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   15. أعد تعليق الحبيبات في 5 مل من محلول التحلل ACK (1 ملي مولار Na²EDTA ؛ 10 ملي مولار KHCO₃ ؛ 144 ملي NH₄Cl ؛ درجة الحموضة 7.2) لتحلل خلايا الدم الحمراء. احتضان تعليق الخلية لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف على الفور 10 مل من محلول PBS إلى تعليق الخلية.
   16. قم بالطرد المركزي للتعليق عند 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 2 مل من محلول PBS.
   17. عد خلايا نخاع العظم باستخدام مقياس كثافة الدم. احتفظ بكمية من 6 × 10⁶ خلايا لتحليل قياس التدفق الخلوي للتحقق من نقاء الخلايا بعد تنقية الخلية (انظر الخطوة 1.2.20).
   18. لاستنفاد الخلايا التائية من معلق نخاع العظم أحادي الخلية ، استخدم مجموعة تنقية الخلايا المتاحة تجاريا. استنفد مغناطيسيا خلايا CD90.2 + (أي الخلايا الليمفاوية) من إجمالي خلايا نخاع العظام ، باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
   19. عد خلايا نخاع العظم المستنفدة للخلايا التائية التي تم عزلها كما هو موضح في الخطوة 1.2.18 ، باستخدام مقياس كثافة الدم. احتفظ بكمية من 1 × 106 خلية لتحليل قياس التدفق الخلوي ليتم إجراؤه لاحقا ، كما هو موضح في الخطوة 1.2.20.
       ملاحظه: عادة ما يكون متوسط إنتاجية الخلايا المستمدة من فأر متبرع واحد من 2 × 107 إلى 3.4 × 107 خلايا نخاع عظم مستنفدة من الخلايا التائية.
   20. تأكيد استنفاد الخلايا التائية بنجاح عن طريق قياس التدفق الخلوي. صبغة 1 × 10⁶ خلايا ، محفوظة من الخطوات 1.2.17 (خلايا نخاع العظم قبل فصل الخلايا المغناطيسية) و 1.2.19 (خلايا نخاع العظم المستنفدة من الخلايا التائية بعد فصل الخلايا المغناطيسية) ، مع الأجسام المضادة التالية: α-CD45.1 (A20) ، α-CD3 (17A2) ، α-CD4 (GK1.5) ، و α-CD8α (53-6.7). استخدم الخلايا المتبقية من الخطوة 1.2.17 كعنصر تحكم غير ملوث ولعناصر التحكم أحادية التلوين ، لإعداد مقياس التدفق الخلوي.
       1. انقل 1 × 10⁶ خلايا من كل عينة إلى بئر من صفيحة 96 بئرا مع قاع V لإجراء تلطيخ التدفق الخلوي.
       2. قم بتدوير الخلايا داخل اللوحة المكونة من 96 بئرا (الخطوة 1.2.20.1) عند 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS (PBS مكمل بمصل بقري مفلتر بنسبة 3٪).
       3. قم بالطرد المركزي للخلايا الموجودة داخل الصفيحة المكونة من 96 بئرا عند 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
       4. أضف كمية مناسبة من الجسم المضاد المختار (مقارنة بالخطوة 1.2.20) إلى العينات للتلوين الفردي في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
       5. تحضير خليط من جميع الأجسام المضادة (المزيج الرئيسي) يحتوي على الكميات المناسبة الكافية لتلطيخ حصصات خلايا نخاع العظم المحفوظة بشكل منفصل من قبل (انظر الخطوة 1.2.17) وبعد (انظر الخطوة 1.2.19) استنفاد الخلايا التائية المغناطيسية. أضف 100 ميكرولتر من المزيج الرئيسي إلى كلا القسمين.
       6. أضف 100 ميكرولتر فقط من المخزن المؤقت FACS إلى العينة غير الملطخة.
       7. احتضان الخلايا داخل اللوحة المكونة من 96 بئرا لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام.
       8. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS وقم بالطرد المركزي للخلايا داخل اللوحة المكونة من 96 بئرا عند 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
       9. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
       10. انقل العينات إلى أنبوب دائري القاع من البوليسترين سعة 5 مل وقم بتحليلها باستخدام أداة مقياس التدفق الخلوي القادرة على اكتشاف جزيئات الفلورسنت التي تم استخدامها لتسمية الأجسام المضادة المستخدمة لتوصيف عينات الخلايا (انظر الخطوة 1.2.20).
       11. قارن تكوين الخلية من قبل وبعد فصل الخلية المغناطيسية.
           ملاحظه: عادة ما يتم تحقيق نقاء حوالي 95٪ من خلايا CD45.1 + CD3- (أي نخاع العظام المستنفد من الخلايا التائية) داخل البوابة الحية.
   21. اغسل معلقات خلايا نخاع العظم المستنفدة من الخلايا التائية 2x بمحلول PBS (450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية) ، وأخيرا ، أعد تعليق الخلايا في محلول PBS ، واضبط تركيز الخلية إلى 5 × 10⁷ خلايا / مل. احتفظ بالخلايا على الثلج الرطب حتى الحقن.
   22. حقن خلايا نخاع العظم المستنفدة من الخلايا التائية في الفئران المتلقية ، والتي تم تعريضها للإشعاع في اليوم السابق (انظر القسم 1.1).
       1. ضع الفأر التجريبي في غرفة مانعة للتسرب وقم بالتخدير عن طريق استنشاق ما يصل إلى 4٪ من الأيزوفلوران ، حتى يفقد الفأر الوعي. تأكد من التسكين وفقدان الوعي عن طريق اختبار فقدان المنعكس الصحيح والفقدان اللاحق لمنعكس سحب الدواسة.
       2. حقن 5 × 10⁶ خلايا نخاع عظمي مستنفدة من الخلايا التائية (أي 100 ميكرولتر من 5 × 10⁷ خلايا / مل) تحتوي على محلول PBS باستخدام حقنة سعة 1 مل مزودة بإبرة 30 جم عن طريق الوريد في الفراغ خلف البصيلة التي تحتوي على الجيوب الأنفية الوريدية.
3. اليوم 2: نقل الخلايا التائية
   ملاحظه: قم بتنفيذ الإجراءات الموضحة أدناه في غطاء مزرعة الأنسجة المعقم واستخدم الكواشف المفلترة. استخدم CD45.2 C57Bl / 6 (من النوع البري ؛ WT) الفئران كمتبرعين للخلايا التائية النشطة. يسمح استخدام أنظمة العلامات المنشأة بالتمييز بين المتلقي (CD45.2 + H2kd + Balb / c الفئران) وأنواع الخلايا المكونة للدم من المتبرع (خلايا نخاع العظام: CD45.1 + H2kb + B6. الفئران SJL; الخلايا التائية الخيفية: CD45.2 + H2kb + C57 / Bl6 الفئران).
   1. القتل الرحيم للفئران C57Bl / 6 وفقا للمبادئ التوجيهية والسلطات المؤسسية المطبقة. لذلك ، قم بتخدير الفئران عن طريق الاستنشاق بتركيز 5٪ من الأيزوفلوران. استمر في التعرض للأيزوفلوران حتى 1 دقيقة بعد توقف التنفس وتأكد من القتل الرحيم عن طريق خلع عنق الرحم. تطهير فراء وجلد الفأر جيدا باستخدام 70٪ من الإيثانول.
   2. ضع مصفاة بشاشة شبكية 40 ميكرومتر على أنبوب تجميع سعة 50 مل. انزع الطحال وضعه على المصفاة.
   3. باستخدام مكبس حقنة ، قم بتقليب الطحال في المصفاة. اغسل المصفاة ومكبس الحقنة باستخدام PBS لجمع كل خلايا الطحال.
   4. الطرد المركزي للخلايا داخل أنبوب التجميع سعة 50 مل عند 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   5. أعد تعليق خلايا الطحال في 3 مل من محلول ACK لتحلل خلايا الدم الحمراء. احتضان تعليق الخلية لمدة 3 دقائق. بعد ذلك ، أضف 10 مل من PBS وقم بالطرد المركزي للخلايا عند 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق خلايا الطحال في PBS.
   6. عد خلايا الطحال باستخدام مقياس كثافة الدم. قم بتحويل كمية من 6 × 10⁶ خلايا لتحليل قياس التدفق الخلوي ، لتقييم حجم التنقية في الخطوة 1.3.9.
   7. للحصول على عزل كامل للخلايا التائية CD3 + عن خلايا الطحال الكلية، استخدم مجموعة تنقية الخلايا المتوفرة تجاريا. عزل الخلايا التائية الطحالية باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
   8. عد خلايا CD3+ T الطحالية المعزولة كما هو موضح في الخطوة 1.3.7 باستخدام مقياس كثافة الدم. احتفظ بكمية من 1 × 10⁶ خلايا T لتحليل قياس التدفق الخلوي.
      ملاحظه: يتراوح العائد المتوسط للخلايا التائية الطحالية لكل فأر متبرع معزول عن طريق فصل الخلايا المغناطيسية من 1.3 × 10⁷ إلى 2 × 10⁷ خلايا.
   9. تأكيد نجاح عزل الخلايا التائية عن طريق قياس التدفق الخلوي. للحصول على وصف تفصيلي لبروتوكول التلوين ، استشر واتبع الخطوات 1.2.20.1 - 1.2.20.10.
      1. وصمة عار 1 × 10⁶ خلايا طحال من الخطوات 1.3.6 (قبل انفصال الخلية المغناطيسية) و 1.3.8 (بعد انفصال الخلية المغناطيسية) مع الأجسام المضادة التالية: α-CD45.2 (104) و α-CD3 (17A2) و α-CD4 (GK1.5) و α-CD8α (53-6.7).
      2. استخدم الخلايا المتبقية من الخطوة 1.3.6 كعنصر تحكم غير ملوث وللتلوين الفردي بالأجسام المضادة المعنية ، لإعداد مقياس التدفق الخلوي.
      3. قارن تكوين الخلية قبل وبعد فصل الخلايا المغناطيسية.
         ملاحظه: يجب تحقيق نقاء بنسبة ≥95٪ من الخلايا التائية CD45.2 + CD3 + داخل البوابة الحية للخلايا الليمفاوية.
   10. اغسل الخلايا التائية 2x باستخدام PBS (450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية) ، وأخيرا ، أعد تعليق الخلايا في محلول PBS ، واضبط تركيز الخلية إلى 7 × 10⁶ خلايا / مل. حافظ على الخلايا على الجليد حتى الحقن.
   11. حقن الخلايا التائية الطحالية الحساسة (انظر الخطوة 1.3.10) في الفئران المشعة BALB / c التي تلقت سابقا خلايا نخاع العظم المستنفدة من الخلايا التائية CD45.1 + (انظر الخطوة 1.2.22).
       1. تحفيز التخدير عن طريق وضع الفأر التجريبي في غرفة مانعة للتسرب حيث يتعرض لما يصل إلى 4٪ من الأيزوفلوران حتى يفقد وعيه. تأكد من التسكين وفقدان الوعي عن طريق اختبار فقدان المنعكس الصحيح والفقدان اللاحق لمنعكس سحب الدواسة.
       2. قم بحقن 0.7 × 10⁶ خلايا CD3 + T alloreactive باستخدام حقنة سعة 1 مل مزودة بإبرة 30 جم (أي 100 ميكرولتر من 7 × 10⁶ خلايا / مل) تحتوي على محلول PBS (انظر الخطوة 1.3.10) ، عن طريق الوريد في الفضاء خلف بصيلة الفئران ، للحث على GvHD. قم بتسمية هذه الفئران كمجموعة تجريبية.
       3. حقن مجموعة مختلفة من الفئران ب 100 ميكرولتر من PBS وحده ، عن طريق الوريد في الفضاء خلف البصيلة ، وقم بتسمية هذه المجموعة على أنها المجموعة الضابطة ، والتي تسمى لاحقا "الفئران غير المزروعة بالخلايا التائية (noT)".

المواد