تقنية لتطوير عدوى الطفيليات في العضيات المعوية عن طريق الحقن المجهري

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Dutta، D.، et al. دراسة عدوى Cryptosporidium في أنظمة الثقافة العضوية البشرية المشتقة من الأنسجة ثلاثية الأبعاد عن طريق الحقن المجهري. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو تقنية الحقن المجهري لتطوير نموذج عدوى عضوية معوية بشرية. يتم حقن مرحلة البوغات المعدية من الطفيلي Cryptosporidium parvum في التجويف العضوي. عند غزو الخلايا الظهارية للعضوية ، يخضع للتكاثر اللاجنسي والجنسي لإكمال دورة حياته وينشر العدوى.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. في المختبر تنقية Sporozoites من C. parvum Oocysts

1. تنقية البوغات من C. parvum البويضات بعد التبييض وغسل المبيض كما هو موضح أعلاه.
   1. انقل البويضات إلى أنبوب سعة 15 مل. قم بتعليق البويضات في وسط استئصال درجة حرارة الغرفة (0.75٪ وزن / حجم من توروكولات الصوديوم في DMEM) للحصول على 1 × 10⁷ بويضات / مل. تعمل إضافة taurocholate على تحسين معدل إفراز البويضات ، مما يحسن من محصول البوغ
   .
   2. احتضان تعليق البويضات عند 37 درجة مئوية لمدة 1-1.5 ساعة.
   3. افحص العينة مجهريا لمعرفة مدى الانبعاث؛ 60-80٪ من الإكساء معقول للتعافي الجيد من البوغ. إذا كان مستوى الإكسيستريشن منخفضا ، فا....

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تحضير وتنقية بويضات Cryptosporidium والبوغ. (أ) التمثيل التخطيطي للطريقة المستخدمة لتحضير البويضات والبوغات للعدوى. (ب) صورة توضح استئصال البويضات في المختبر. يعطي ترشيح البويضات والأصداف غير المكسوة محلولا منقى من الأبوغ. شريط المقياس = 10 ميكرومتر.

....

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مستخلص الغشاء القاعدي (مصفوفة خارج الخلية) أمسبيو 3533-010-02 رف Dynamag 15 ثيرموفيشر العلمي 12301 د رف Dynamag 2 ثيرموفيشر العلمي 12321 د مرشحات غشاء البولي كربونات EMD Millipore Isopore - 3 ميكرومتر EMD-ميليبور TSTP02500 صبغة خضراء سريعة سيغما F7252-5G حاقن Femtojet 4i Microinquor إيبندورف 5252000013 الشعيرات الدموية الزجاجية بقطر 1 مم WPI TW100F-4 Matrigel (مصفوفة خارج الخلية) كورنينج 356237 أنبوب الطرد الدقيق 1.5 مل إيبندورف تي 9661-1000EA نصائح اللودر الصغير إيبندورف 612-7933 مجتذب الماصات الدقيقة P-97 أداة الغالق ف-97 بنسترب جيبكو 15140-122 هيبوكلوريت الصوديوم (استخدم 5٪) كلوركس 50371478 شرائح العصا الفائقة Waterborne ، Inc S100-3 Swinnex-25 حامل فلتر بولي كربونات 47 مم EMD-ميليبور SX0002500 هيدرات ملح الصوديوم حمض التوروكوليك سيغما T4009-5G توين 20 ميرك 8221840500 دوامة الجني 2 الصناعات العلمية ، Inc SI0236 Adv +++ (DMEM + Penstrep + Glutamax + Hepes) المبلغ النهائي DMEM إنفيتروجين هاتف: 12634-010 500 مل بنسترب جيبكو 15140-122 5 مل من المرق في 500 مل DMEM جلوتاماكس جيبكو 35050038 5 مل من المرق في 500 مل DMEM هيبس جيبكو 15630056 5 مل من المرق في 500 مل DMEM الوسائط العضوية المعوية OME (وسائط التمدد) التركيز النهائي أ 83-01 توكرس 2939-50 ملغ 0.5 ميكرومتر Adv+++ اصنع ما يصل إلى 100 مل ب 27 إنفيتروجين 17504044 1 مرة EGF بيبروتك AF-100-15 50 نانوغرام / مل جاسترين توكرس 3006-1 ملغ 10 نانومتر NAC سيغما أ 9125-25 جي 1.25 ملي NIC سيغما N0636-100G 10 مللي متر نوجين سي ام في المنزل* 10٪ مثبط P38 (SB202190) سيغما S7076-25 ملغ 10 ميكرومتر PGE2 توكرس 2296-10 10 نانومتر بريموسين إنفيفوجين النمل PM-1 وسائط 1 مل / 500 مل RSpoI CM في المنزل* 20٪ Wnt3a سم في المنزل* 50٪ في المنزل* - سيتم توفير خطوط الخلوية عند الطلب الوسائط العضوية المعوية - OMD (وسائط التمايز) للتمييز بين العضيات ، نمت العضيات المعوية الدقيقة المتوسعة في وسط غني ب Wnt لمدة ستة إلى سبعة أيام بعد الانقسام ، ثم نمت في وسط تمايز (سحب Wnt ، نيكوتيناميد ، SB202190 ، في وسط تمايز (سحب Wnt ، نيكوتيناميد ، SB202190 ، البروستاجلاندين E2 من وسط غني ب Wnt أو OME) تقليل المخزن المؤقت (لإعادة تعليق البويضات والبوغات للحقن) التركيز النهائي انخفض L-Glutathione سيغما G4251-10 ملغ 0.5 ميكروغرام/ميكرولتر من OME/OMD/LOM البيتين سيغما 61962 0.5 ميكروغرام/ميكرولتر من OME/OMD/LOM L-سيستين سيغما 168149-2.5 جرام 0.5 ميكروغرام/ميكرولتر من OME/OMD/LOM حمض اللينوليك سيغما L1376-10 ملغ 6.8 ميكروغرام / مل من OME / OMD / LOM التورين سيغما T0625-10 ملغ 0.5 ميكروغرام/ميكرولتر من OME/OMD/LOM