تقنية لتطوير عدوى الطفيليات في العضيات المعوية عن طريق الحقن المجهري

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Dutta، D.، et al. دراسة عدوى Cryptosporidium في أنظمة الثقافة العضوية البشرية المشتقة من الأنسجة ثلاثية الأبعاد عن طريق الحقن المجهري. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو تقنية الحقن المجهري لتطوير نموذج عدوى عضوية معوية بشرية. يتم حقن مرحلة البوغات المعدية من الطفيلي Cryptosporidium parvum في التجويف العضوي. عند غزو الخلايا الظهارية للعضوية ، يخضع للتكاثر اللاجنسي والجنسي لإكمال دورة حياته وينشر العدوى.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. في المختبر تنقية Sporozoites من C. parvum Oocysts

1. تنقية البوغات من C. parvum البويضات بعد التبييض وغسل المبيض كما هو موضح أعلاه.
   1. انقل البويضات إلى أنبوب سعة 15 مل. قم بتعليق البويضات في وسط استئصال درجة حرارة الغرفة (0.75٪ وزن / حجم من توروكولات الصوديوم في DMEM) للحصول على 1 × 10⁷ بويضات / مل. تعمل إضافة taurocholate على تحسين معدل إفراز البويضات ، مما يحسن من محصول البوغ
   .
   2. احتضان تعليق البويضات عند 37 درجة مئوية لمدة 1-1.5 ساعة.
   3. افحص العينة مجهريا لمعرفة مدى الانبعاث؛ 60-80٪ من الإكساء معقول للتعافي الجيد من البوغ. إذا كان مستوى الإكسيستريشن منخفضا ، فاحتضن لفترة أطول (30 دقيقة أخرى إلى 1 ساعة).
   4. حدد النسبة المئوية للاستئصال بالنسبة لعدد البويضات البدءة. يتم حساب الخروج على النحو التالي:
      النسبة المئوية للاستئصال = [1 - (عدد البويضات السليمة / عدد البويضات في البداية)] × 100
   5. اغسل الخلايا لإزالة الكواشف المفرطة عن طريق إضافة 14 مل من PBS أو الخلايا المتوسطة والخلط والاستعادة (البويضات السليمة ، وقشور البويضات ، والبوغ) عن طريق الطرد المركزي عند 3,400 × جم لمدة 20 دقيقة لاستعادة الأبواغ. الشفط بعناية لتجنب فقدان الخلايا.
   6. أعد تعليق حبيبات البوغية في 1-2 مل من DMEM للحصول على 3 × 10⁷ بويضات / مل (بناء على عدد البويضات البدءة).
   7. لإزالة البويضات والأصداف المتبقية ، قم بتصفية التعليق من خلال مرشح 3 ميكرومتر (الشكل 1 ب). استخدم جهاز حامل مرشح مقاس 47 مم مزود بفلتر بولي كربونات (حجم المسام 3 ميكرومتر) متصل ببرميل حقنة سعة 10 مل. ضع جهاز حامل الفلتر فوق أنبوب سعة 15 مل. ضع المجموعة في دلو ثلج أو في غرفة باردة.
   8. أضف 7.5 مل من تعليق البوغية إلى مجموعة المرشح واتركه بالترشيح عن طريق الجاذبية. يغسل ب 7.5 مل أخرى من DMEM.
      ملاحظه: لضمان النجاح في عزل البوغات ، تعتبر البويضات الطازجة والاستئصال الجيد أمرا بالغ الأهمية. إذا كان هناك عدد كبير جدا من البويضات غير المكسوة ، فلن يتدفق المعلق عن طريق الجاذبية. يمكن أن يؤدي الضغط على المحقنة إلى إجبار البويضات غير المكسورة على المرور. يعد الحقن المجهري للبويضات أكثر صعوبة من البويضات لأن البوغات قد تتكتل وتسد الشعيرات الدموية. لتجنب ذلك ، نوصي بعمل طرف شعري أوسع عند حقن العضيات بالبوغ. لتحقيق مستويات كافية من العدوى ، يجب حقن 2-4 أضعاف عدد البوغيات في كل عضوية مقارنة بالعضيات المصابة بالبويضات.
   9. جهاز الطرد المركزي لتعليق البوغات المصفى عند 3,400 × جم باستخدام دوار دلو متأرجح لمدة 20 دقيقة لبيليه البوغ.
   10. أعد التعليق في 50-100 ميكرولتر من وسط الاستزراع العضوي OME أو OMD (انظر جدول المواد) مع 0.05٪ (وزن / حجم) صبغة خضراء سريعة و L-glutathione ، والبيتين ، و L-cysteine ، وحمض اللينوليك ، والمخزن المؤقت المختزل المحتوي على التورين (انظر جدول المواد).
       ملاحظه: قد يؤدي احتضان البويضات لفترة طويلة إلى تحلل البوغات وضعف الشفاء ، وبالتالي يجب تجنبها.

< ص الفئة = "jove_title" >2. في المختبر الثقافة المعوية البشرية للحقن المجهري

1. ثقافة العضيات المعوية في ظل ظروف وسائط التمدد والتمايز.
   ملاحظة: تم وصف تفاصيل التكاثر المعوي مسبقا في مقالات أخرى (انظر جدول المواد للحصول على وصفات الوسائط). هنا ، نصف بإيجاز طريقة الثقافة العضوية مع إشارة محددة إلى تحسين حقن Cryptosporidium ونموه. لقد وجدنا أنه بالنسبة لتصوير الطفيليات في العضيات ، فإن العضيات المزروعة في وسط التمدد أفضل من تلك التي تزرع في وسط التمايز حيث يوجد تراكم أقل للحطام من ذلك الذي يظهر في العضيات المزروعة في وسط التمايز. ومع ذلك ، إذا كان الهدف هو عزل البويضات ، فإن العضيات المزروعة في وسائط التمايز تنتج أعدادا أكبر بكثير من البويضات.
   1. حافظ على العضيات في الثقافات ثلاثية الأبعاد في مصفوفة خارج الخلية (انظر جدول المواد) عند 37 درجة مئوية. أضف OME (وسائط التمدد العضوي) في الأعلى وقم بتحديثها كل يوم.
   2. لتقسيم العضيات وصفيحتها للحقن المجهري ، قم بإزالة الوسائط من الصفيحة المكونة من 6 آبار التي تحتوي على عضيات بشرية ، أضف F12 +++ (انظر جدول المواد) إلى البئر ، وقم بتفكيك المصفوفة عن طريق سحب العينة بطرف ماصة سعة 1 مل عدة مرات. اجمع الخلايا في أنبوب سعة 15 مل (2 مل من F12 +++ لكل أنبوب يكفي لمزيد من الإجراءات).
   3. أضف 10-12 مل من F12 +++ في أنبوب آخر سعة 15 مل وضع ماصة زجاجية مصقولة بالنار في الوسط ، وقم برفع الماصة لأعلى ولأسفل 3 مرات لتفتيت العضيات المعوية البشرية.
      ملاحظه: استخدم ماصة زجاجية طويلة (20-30 سم) وقم بتلميعها بالنار لفترة وجيزة. لا تجعل الفتحة (قطرها 1 مم) صغيرة جدا لأن العضيات يمكن أن تتلف. اجعل طرف الماصة ناعما عن طريق تلميعه بالنار لفترة وجيزة. قسم العضيات إلى قطع أصغر من ~ 50 ميكرومتر.
   4. أضف F12 +++ حتى 5-7 مل وجهاز الطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق < br / > ملاحظه: سرعة الطرد المركزي في هذه الخطوة أعلى من المعتاد من أجل صنع حبيبات خلية جيدة مفصولة جيدا عن المصفوفة خارج الخلية (انظر جدول المواد). لقد لاحظنا أنه بالمقارنة مع عضيات الأمعاء الدقيقة للفأر ، يصعب تعطيل عضيات الأمعاء الدقيقة البشرية.
   5. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الوسط دون إزعاج الخلايا ، ثم أعد تعليق الحبيبات بمصفوفة محفوظة عند 4 درجات مئوية ؛ مطلوب 200-300 ميكرولتر من المصفوفة لكل بئر من صفيحة من ستة آبار. يجب تقسيم العضيات واحدة إلى ثلاثة للحفاظ على كثافة خلايا عالية إلى حد ما.
   6. ضع العضيات في قطرات مصفوفة من حوالي 5-10 ميكرولتر لكل منها في بئر صفيحة من ستة آبار. احتضن لمدة 20-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ثم أضف وسط التمدد (OME) في الأعلى.
   7. قم بتغيير الوسيط كل 2-3 أيام.
      ملاحظه: في حوالي 5-7 أيام ، تصل العضيات التي تنمو في EM إلى حجم 100-200 ميكرومتر وتكون جاهزة للحقن.
   8. للتمييز بين العضيات ، بعد 5-6 أيام في EM ، قم بتغيير الوسائط إلى ظروف وسائط التمايز (DM) واحتفظ بها لمدة 5-6 أيام إضافية قبل حقن الطفيليات.
      ملاحظه: لتوسيع العضيات ، يوصى بطلاء العضيات بكثافة. بالنسبة للحقن المجهري ، يوصى باستخدام صفيحة من ستة آبار مع عضيات مطلية بكثافة أقل. على سبيل المثال ، صفائح العضيات من ثلاثة آبار من صفيحة من ستة آبار إلى صفيحة كاملة من ستة آبار للحقن المجهري. يجب الحفاظ على المصفوفة عند -20 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل وإذابة الجليد عند 4 درجات مئوية أو على الجليد قبل الاستخدام.

فئة < p = "jove_title" >3. الحقن المجهري للبويضات / البوغات في التجويف العضوي

1. حقن الطفيليات الدقيقة في الجانب القمي من العضوية ثلاثية الأبعاد (الشكل 2).
   1. قم بإعداد الشعيرات الدموية الزجاجية بقطر 1 مم باستخدام مجتذب ماصة دقيقة.
      ملاحظه: الإعدادات المستخدمة في مجتذب الماصة الدقيقة (انظر جدول المواد) هي الحرارة = 663 ، السحب = 100 ، السرعة = 200 ، الوقت = 40 مللي ثانية. يجب ضبط الإعدادات وفقا لتعليمات المستخدم لجهاز معين.
   2. قطع طرف الشعيرات الدموية بالملقط. يبلغ حجم / قطر الطرف الشعري حوالي 9-12 ميكرومتر. يتيح ذلك سهولة تدفق البويضات (حجم 4-5 ميكرومتر).
   3. املأ الشعيرات الدموية بتعليق البويضات أو البوغية باستخدام أطراف اللودر الدقيق.
   4. قم بتحميل الشعيرات الدموية المملوءة بالبويضات على حاقن دقيق.
   5. حقن معلق 100-200 نانولتر في كل عضوية تحت مجهر مقلوب بتكبير 5x ، مع الحفاظ على الضغط ثابتا. بعد الحقن المجهري ، قم بتحديث الوسائط باستخدام OME أو OMD (وسيط التمايز العضوي) كل يوم وحافظ على اللوحة عند 37 درجة مئوية
      ملاحظه: نحن لا نستخدم معالج دقيق للحقن المجهري. يوصى باستخدام نفس الشعيرات الدموية للتجربة بأكملها لضمان الحقن المتساوي في كل عينة.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تحضير وتنقية بويضات Cryptosporidium والبوغ. (أ) التمثيل التخطيطي للطريقة المستخدمة لتحضير البويضات والبوغات للعدوى. (ب) صورة توضح استئصال البويضات في المختبر. يعطي ترشيح البويضات والأصداف غير المكسوة محلولا منقى من الأبوغ. شريط المقياس = 10 ميكرومتر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مستخلص الغشاء القاعدي (مصفوفة خارج الخلية) أمسبيو 3533-010-02 رف Dynamag 15 ثيرموفيشر العلمي 12301 د رف Dynamag 2 ثيرموفيشر العلمي 12321 د مرشحات غشاء البولي كربونات EMD Millipore Isopore - 3 ميكرومتر EMD-ميليبور TSTP02500 صبغة خضراء سريعة سيغما F7252-5G حاقن Femtojet 4i Microinquor إيبندورف 5252000013 الشعيرات الدموية الزجاجية بقطر 1 مم WPI TW100F-4 Matrigel (مصفوفة خارج الخلية) كورنينج 356237 أنبوب الطرد الدقيق 1.5 مل إيبندورف تي 9661-1000EA نصائح اللودر الصغير إيبندورف 612-7933 مجتذب الماصات الدقيقة P-97 أداة الغالق ف-97 بنسترب جيبكو 15140-122 هيبوكلوريت الصوديوم (استخدم 5٪) كلوركس 50371478 شرائح العصا الفائقة Waterborne ، Inc S100-3 Swinnex-25 حامل فلتر بولي كربونات 47 مم EMD-ميليبور SX0002500 هيدرات ملح الصوديوم حمض التوروكوليك سيغما T4009-5G توين 20 ميرك 8221840500 دوامة الجني 2 الصناعات العلمية ، Inc SI0236 Adv +++ (DMEM + Penstrep + Glutamax + Hepes) المبلغ النهائي DMEM إنفيتروجين هاتف: 12634-010 500 مل بنسترب جيبكو 15140-122 5 مل من المرق في 500 مل DMEM جلوتاماكس جيبكو 35050038 5 مل من المرق في 500 مل DMEM هيبس جيبكو 15630056 5 مل من المرق في 500 مل DMEM الوسائط العضوية المعوية OME (وسائط التمدد) التركيز النهائي أ 83-01 توكرس 2939-50 ملغ 0.5 ميكرومتر Adv+++ اصنع ما يصل إلى 100 مل ب 27 إنفيتروجين 17504044 1 مرة EGF بيبروتك AF-100-15 50 نانوغرام / مل جاسترين توكرس 3006-1 ملغ 10 نانومتر NAC سيغما أ 9125-25 جي 1.25 ملي NIC سيغما N0636-100G 10 مللي متر نوجين سي ام في المنزل* 10٪ مثبط P38 (SB202190) سيغما S7076-25 ملغ 10 ميكرومتر PGE2 توكرس 2296-10 10 نانومتر بريموسين إنفيفوجين النمل PM-1 وسائط 1 مل / 500 مل RSpoI CM في المنزل* 20٪ Wnt3a سم في المنزل* 50٪ في المنزل* - سيتم توفير خطوط الخلوية عند الطلب الوسائط العضوية المعوية - OMD (وسائط التمايز) للتمييز بين العضيات ، نمت العضيات المعوية الدقيقة المتوسعة في وسط غني ب Wnt لمدة ستة إلى سبعة أيام بعد الانقسام ، ثم نمت في وسط تمايز (سحب Wnt ، نيكوتيناميد ، SB202190 ، في وسط تمايز (سحب Wnt ، نيكوتيناميد ، SB202190 ، البروستاجلاندين E2 من وسط غني ب Wnt أو OME) تقليل المخزن المؤقت (لإعادة تعليق البويضات والبوغات للحقن) التركيز النهائي انخفض L-Glutathione سيغما G4251-10 ملغ 0.5 ميكروغرام/ميكرولتر من OME/OMD/LOM البيتين سيغما 61962 0.5 ميكروغرام/ميكرولتر من OME/OMD/LOM L-سيستين سيغما 168149-2.5 جرام 0.5 ميكروغرام/ميكرولتر من OME/OMD/LOM حمض اللينوليك سيغما L1376-10 ملغ 6.8 ميكروغرام / مل من OME / OMD / LOM التورين سيغما T0625-10 ملغ 0.5 ميكروغرام/ميكرولتر من OME/OMD/LOM