تصور المصائد خارج الخلية في البلاعم من سوائل غسل الشعب الهوائية البشرية

Abstract

المصدر: Sharma ، R. et al. ، تصور مصائد البلاعم خارج الخلية باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو الوسم المناعي لمصائد البلاعم خارج الخلية ، METs ، في البلاعم السنخية القصبية من سائل الغسيل القصبي السنخي ، وتصورها باستخدام المجهر متحد البؤر.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. غسل القصبات الهوائية (BAL) الضامة

1. استخدم BAL للحصول على البلاعم الرئوية في (1) أشخاص بشريين عن طريق تنظير القصبات ، و (2) الفئران باستخدام الشفط داخل القصبة الهوائية.
   ملاحظه: يؤدي اكتساب البلاعم بشكل عام إلى بعض تنشيط هذه الخلايا. يتم الحصول على البلاعم من المرضى الذين يحتاجون إلى تنظير القصبات للتحقيق في مشكلة طبية محتملة ، وقد لا تكون جميع الموضوعات مناسبة لتحليل مصائد البلاعم خارج الخلية ، أو METs (يجب تحديد ذلك لكل مشروع على حدة).
   1. خذ محلول BAL وقم بتدويره لأسفل (500 × جم لمدة 10 دقائق) لتشكيل حبيبات ، واغسله مرتين بوسط المزرعة (معهد روزويل بارك التذكاري المتوسط (RPMI) مع مصل ربلة الساق الجنينية 5٪ و 1٪ L-glutamine) في درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بتخفيف الخلايا في 4 مل من وسط الاستزراع.
   2. إذا لزم الأمر ، اطلب عد تفاضلي رسمي ؛ ستكون معظم الخلايا (بشكل عام >80٪) عبارة عن ضامة><. ملاحظه: سيتم تنفيذ ذلك بشكل عام من خلال خدمة الأنسجة السريرية باستخدام المظهر المورفولوجي لأنواع الخلايا المختلفة.
   3. قم بإجراء عدد خلايا البلاعم القابل للتطبيق على محلول BAL باستخدام استبعاد Trypan blue ومقياس كثافة الدم.
      ملاحظه: يتم الحصول على محلول BAL من البشر والفئران كما هو مذكور في الخطوة 1.1.
   4. أضف 1 - 4 × 10⁵ بلاعم إلى ألواح 24 بئرا على أغطية في 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع لكل بئر واتركها طوال الليل عند 37 درجة مئوية ؛ ستلتصق الخلايا بالغطاء. بالنسبة للعينات البشرية ، أضف المضادات الحيوية (على سبيل المثال ، البنسلين والستربتومايسين ، 10⁴ وحدة / مل) لمنع التلوث البكتيري.

< p class = "jove_title" >2. وضع العلامات المناعية / الفحص المجهري للبلاعم BAL

ملاحظة: يتم الالتزام بالخلايا بطبقات الغطاء كما هو مذكور أعلاه.

1. قم بإزالة وسط المزرعة وغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). قم بإصلاح الخلايا في مثبت بارافورمالدهيد / دوريات / ليسين (PLP) بنسبة 2٪ لمدة 10 دقائق.
2. اغسل الخلايا لفترة وجيزة في PBS ، ثم تخلل في 0.2٪ Tween 20 في PBS لمدة 20 دقيقة.
3. قم بحظر الخلايا التي تحتوي على 10٪ مصل دجاج في 5٪ ألبومين مصل بقري (BSA) مخفف في PBS لمدة 30 دقيقة.
4. احتضان الأجسام المضادة الأولية والتحكم في النمط المتماثل لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة بتركيزات 1: 100 (يتم سرد المزيد من التفاصيل المحددة في جدول المواد) عند 37 درجة مئوية
   ملاحظه: بالنسبة لعينات BAL ، عادة ما تكون هناك حاجة إلى علامة محددة من البلاعم.
5. بعد إضافة الأجسام المضادة الأولية ، اغسل الخلايا في PBS ، واحتضن الأجسام المضادة الثانوية المقابلة لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
6. اغسل الأقسام في PBS وقم بتركيبها بوسيط تثبيت قائم على DAPI للتصور باستخدام مجهر متحد البؤر (كما هو مذكور أعلاه) في إثارة الليزر 405 و 488 و 561 و 647 نانومتر وهدف زيت 40X و 1.0 NA.

Materials