تقنية التلقيح بالرش لإثبات العدوى الفطرية في أوراق نبات الأرز

الملخص

المصدر: Zhang, M., et al. اختبار عدوى النبات: الرش والتلقيح بوساطة الجرح باستخدام العامل الممرض النباتي Magnaporthe Grisea. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو تقنية لإثبات عدوى الفطريات المسببة للأمراض Magnaporthe grisea في أوراق نبات الأرز. يتم رش معلق الكونيديا الفطري على أجزاء من أوراق الأرز ، ويتم تقييم تطور المرض عن طريق تسجيل تكوين الآفات النخرية.

البروتوكول

فئة < p = "jove_title" >1. رش التلقيح بتعليق M. grisea conidia

1. الثقافة الفطرية ل M.grisea
   1. تحضير وسط زراعة دقيق الشوفان الطماطم (OTA) للسلالات الفطرية.
   2. يزن 30-50 جم من دقيق الشوفان ، وأضفه إلى 800 مل من الماء المقطر / منزوع الأيونات (ddH₂O) ، ويغلى المزيج لمدة 30 دقيقة في القدر الكهربائي.
   3. قم بتصفية عصير الشوفان المسلوق في الدورق من خلال قطعة من الشاش.
   4. أضف 150 مل من عصير الطماطم و 20 جم من الأجار إلى المرشح في الدورق وأضف ddH₂O حتى 1,000 مل.
2. تحضير المواد التجريبية
   1. انقع حوالي 50 بذرة من الأرز (Oryza sativa) صنف Lijiangxintuan-heigu (LTH) في ddH₂O لمدة 3 أيام أو انقع حوالي 50 بذرة من الشعير (Hordeum vulgare cv Golden Promise) في ddH₂O لمدة 1 يوم تقريبا.
   2. لف بذور الأرز أو الشعير بشاش رطب وأنبتها على ورق ترشيح رطب في حوالي 30 طبق بتري بقطر 10 سم × 10 سم عند 28 درجة مئوية. يبلغ وقت إنبات بذور الأرز حوالي 2-3 د ، ووقت إنبات بذور الشعير حوالي 2 يوم. تبلغ الرطوبة النسبية في الدفيئة حوالي 70٪.
   3. ازرع شتلات الأرز أو الشعير في أواني باستخدام تربة تأصيص معقمة بالتعقيم وسقيها ثم قم بتغطيتها بطبقة من الفيرميكوليت.
   4. ضع النباتات في منزل زجاجي مناسب أو خزانة نمو عند 25 درجة مئوية لمدة 1 ~ 2 أسبوع تقريبا.
   5. قم بقص 3 طبقات من ورق الترشيح في دوائر بمقص جراحي معقم (يجب أن يكون قطر كل دائرة 8 سم) وضعها على ألواح بلاستيكية معقمة مقاس 100 مم.
   6. أضف ddH₂O إلى كل طبق لنقع ورق الترشيح.
   7. تأكد من أن ورق الترشيح مبلل تماما ولكن لا تضاف الماء الإضافي.
   8. قم بإزالة أي ماء زائد بمضخة تفريغ.
   9. ضع 2 من أعواد الأسنان المعقمة في طبق المزرعة لدعم أوراق الأرز / الشعير ؛ باعد بين أعواد الأسنان ~ 2 - 3 سم.
   10. اجمع أوراق الأرز بعد أسبوعين من زرع البذور أو خذ أوراق الشعير بعد 7 أيام من زرع البذور.
   11. باستخدام شتلات من 4 إلى 6 أوراق من الأرز / الشعير ، اقطع الجزء السفلي من الساق على بعد ~ 5 سم من الأعلى واجمع الأوراق.
3. بروتوكول التلقيح بالرش
   1. استزراع السلالة الفطرية على ألواح OTA في حاضنة ثرموستاتي (25 درجة مئوية) لمدة ~ 4 د.
   2. أضف ~ 2 مل من ddH₂O باستخدام ماصة 0.5 - 5 مل لكل طبق عمره 4 أيام.
   3. باستخدام حلقة التلقيح ، اكشط فطريات السلالة البرية من M. grisea والسلالة الطافرة في حطام الفطريات.
   4. اجمع بقايا الفطريات وانقلها إلى لوحة OTA جديدة. خذ بقايا الفطريات وجففها بالمجفف على المقعد النظيف.
   5. قم بتغطية اللوحة ب 3 طبقات من الشاش لضمان الرطوبة المطلوبة لنمو الكونيديا في دفيئة عند 25 درجة مئوية خلال النهار (14 ساعة) و 23 درجة مئوية في الليل (10 ساعات) لمدة 24-48 ساعة.
   6. أضف 2 مل من ddH₂O إلى كل طبق واكشط الكونيديا برفق باستخدام مسحات قطنية معقمة متبوعة بترشيح من خلال طبقتين من ورق العدسة. احرص على عدم خدش سطح وسط الاستزراع.
   7. انقل معلق الكونيديا إلى أنبوب جديد سعة 50 مل بماصة سعة 100 - 1,000 ميكرولتر.
   8. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق بحد أدنى 5,000 × جم عند 25 درجة مئوية.
   9. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات لإعطاء 2 × 10⁴ كونيديا لكل مل في محلول Tween-20 بنسبة 0.025٪ (حجم / حجم). عادة ما يكون محلول Tween-20 حوالي 10-20 مل.
   10. صب معلق البوغ في بخاخ يدوي.
   11. قم بتعقيم حوالي 10 مل من المعلق المخروطي على أوراق الأرز لشتلات الأرز البالغة من العمر أسبوعين أو أوراق الشعير لشتلات الشعير التي يبلغ عمرها 7 أيام واحتضانها عند 25 درجة مئوية في غرفة مظلمة ورطبة لمدة ~ 24 ساعة. رش نباتات التحكم بمحلول Tween-20 بنسبة 0.025٪ (v / v).
   12. انقل الأوراق إلى غرفة رطبة أخرى تحت ضوء الفلورسنت عند 25 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.
   13. سجل أعراض المرض في 5 أيام بعد التلقيح. افحص شفرات الأرز / الشعير المريضة التي يبلغ طولها ~ 6 سم. يتوافق معيار التقييم مع نظام تسجيل المقاومة للانفجار التابع للمعهد الدولي لبحوث الأرز (IRRI). يتم عرض تفاصيل نظام التسجيل لمقاومة الانفجار في الجدول 1.
   14. قم بتصوير الأوراق لتقييم إصابة السلالات المختبرة. تم تقييم العدوى من خلال عدد الآفات لكل 3.6 سم².

الجدول 1: نظام تسجيل لمقاومة الانفجار. الجدول مقتبس من المعهد الدولي لبحوث الأرز (IRRI).

مِيزَان وصف 1 بقع بنية صغيرة بحجم دقيق 2 بقع رمادية صغيرة مستديرة إلى ممدودة قليلا ، قطرها حوالي 1-2 مم ، بهامش بني مميز. توجد الآفات في الغالب على الأوراق العلوية 3 نوع الآفة هو نفسه كما في 2 ، ولكن يوجد عدد كبير من الآفات على الأوراق العلوية 4 آفات انفجارية نموذجية حساسة ، 3 مم أو أكثر ، تصيب أقل من 4٪ من مساحة الورقة 5 آفات انفجارية نموذجية حساسة ، 3 مم أو أكثر ، تصيب أقل من 4-10٪ من مساحة الورقة 6 آفات انفجارية نموذجية حساسة ، 3 مم أو أكثر ، تصيب أقل من 11-25٪ من مساحة الأوراق 7 آفات انفجارية نموذجية حساسة ، 3 مم أو أكثر ، تصيب أقل من 26-50٪ من مساحة الورقة 8 آفات انفجارية نموذجية حساسة ، 3 مم أو أكثر ، تصيب أقل من 51-75٪ من مساحة الأوراق ، والعديد من الأوراق ميتة 9 تصيب آفات الانفجار النموذجية الحساسة ، 3 مم أو أكثر ، أكثر من 75٪ من مساحة الورقة

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات اجار AOBOX Biotechnology (الصين) 01-023 ورق الترشيح العلامة التجارية GE للرعاية الصحية (السويد) 10311387 أنبوب 50 مل كورنينج (أميرسيا) هاتف: 430290 الطرد المركزي إيبندورف (أميرسيا) 5804 ص توين 20 Coolaber (الصين) CT11551-100 مل طبق ثقافة ثيرموفيشر (Amercia) 150326 ماصة 0.5-5 مل إيبندورف 4920000105 ماصة 100-1000uL إيبندورف 4920000083 مضخة فراغ ليبولد د25 ب حاضنه ميمرت باك 313 حلقة التلقيح غرينر بيو وان 731175