إنشاء عدوى أوراق نبات الأرز من خلال التلقيح الفطري عن طريق الجرح

الملخص

المصدر: Zhang ، M. et al. ، اختبار عدوى النبات: الرش والتلقيح بوساطة الجرح باستخدام مسببات الأمراض النباتية Magnaporthe Grisea.J. Vis. Exp.(2018)

يوضح هذا الفيديو إنشاء عدوى أوراق نبات الأرز من خلال التلقيح الجرحي بفطريات Magnaporthe grisea. يخترق الأنبوب الجرثومي المشتق من الأبواغ الفطرية طبقة البشرة ، مما يؤدي إلى إصابة الأنسجة والآفات على الأوراق. تساعد هذه الطريقة في فحص النمط المرضي وتحسن فهم مقاومة النبات للتربية الجزيئية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. الثقافة الفطرية ل M.grisea

1. تحضير وسط زراعة دقيق الشوفان الطماطم (OTA) للسلالات الفطرية.
2. يزن 30-50 جم من دقيق الشوفان ، وأضفه إلى 800 مل من الماء المقطر / منزوع الأيونات (ddH₂O) ، ويغلى المزيج لمدة 30 دقيقة في القدر الكهربائي.
3. قم بتصفية عصير الشوفان المسلوق في الدورق من خلال قطعة من الشاش.
4. أضف 150 مل من عصير الطماطم و 20 جم من الأجار إلى المرشح في الدورق وأضف ddH₂O حتى 1,000 مل.

< p class = "jove_title" >2. تحضير المواد التجريبية

1. انقع حوالي 50 بذرة من الأرز (Oryza sativa) صنف Lijiangxintuan-heigu (LTH) في ddH₂O لمدة 3 أيام أو انقع حوالي 50 بذرة من الشعير (Hordeum vulgare cv Golden Promise) في ddH₂O لمدة 1 يوم تقريبا.
2. لف بذور الأرز أو الشعير بشاش رطب وأنبتها على ورق ترشيح رطب في حوالي 30 طبق بتري بقطر 10 سم × 10 سم عند 28 درجة مئوية. يبلغ وقت إنبات بذور الأرز حوالي 2-3 د ، ووقت إنبات بذور الشعير حوالي 2 يوم. تبلغ الرطوبة النسبية في الدفيئة حوالي 70٪.
3. ازرع شتلات الأرز أو الشعير في أواني باستخدام تربة تأصيص معقمة بالتعقيم وسقيها ثم قم بتغطيتها بطبقة من الفيرميكوليت.
4. ضع النباتات في منزل زجاجي مناسب أو خزانة نمو عند 25 درجة مئوية لمدة 1 ~ 2 أسبوع تقريبا.
5. قم بقص 3 طبقات من ورق الترشيح في دوائر بمقص جراحي معقم (يجب أن يكون قطر كل دائرة 8 سم) وضعها على ألواح بلاستيكية معقمة مقاس 100 مم.
6. أضف ddH₂O إلى كل طبق لنقع ورق الترشيح.
7. تأكد من أن ورق الترشيح مبلل تماما ولكن لا تضاف الماء الإضافي.
8. قم بإزالة أي ماء زائد بمضخة تفريغ.
9. ضع 2 من أعواد الأسنان المعقمة في طبق المزرعة لدعم أوراق الأرز / الشعير ؛ باعد بين أعواد الأسنان ~ 2 - 3 سم.
10. اجمع أوراق الأرز بعد أسبوعين من زرع البذور أو خذ أوراق الشعير بعد 7 أيام من زرع البذور.
11. باستخدام شتلات من 4 إلى 6 أوراق من الأرز / الشعير ، اقطع الجزء السفلي من الساق على بعد ~ 5 سم من الأعلى واجمع الأوراق.

< p class = "jove_title" >3. جرح التلقيح بمكعبات الفطريات أو قطرات من التعليق المخروطي ل M. grisea

1. باستخدام إبرة تشريحية ، اكشط ثلاثة جروح بطول 2-3 سم في الأوردة الرئيسية لأوراق الأرز / الشعير المنفصلة ؛ احرص على عدم اختراق الأوراق.
2. ضعي الأوراق المكشورة على أعواد الأسنان ورشي محلول Tween-20 بنسبة 0.02٪ (v / v) على الأوراق لتشكيل طبقة من القطرات.
3. قم بقص سدادة فميلية 0.5 سم × 0.5 سم لكل سلالة M. grisea (من النوع البري ، أو المتحولة ، أو السلالات التكميلية ، أو سلالات الاختبار الأخرى) من لوحة OTA.
4. ضع المقابس الفطرية أو 25 ميكرولتر قطرات من التعليق المخروطي على الأوراق المصابة واحتضان الأوراق عند 25 درجة مئوية في غرفة رطبة لمدة 3-8 أيام.
5. فحص الآفات في 5 - 7 أيام بعد التلقيح. طريقة الفحص هي نفسها التي كانت عليها في طريقة التلقيح بالرش (انظر الخطوة 1.3.13).
6. افحص شفرات الأرز / الشعير المريضة التي يبلغ طولها ~ 6 سم وقم بتصويرها لتقييم إصابة السلالات المختبرة. تم تقييم العدوى من خلال عدد الآفات لكل 3.6 سم².

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات اجار AOBOX Biotechnology (الصين) 01-023 ورق الترشيح العلامة التجارية GE للرعاية الصحية (السويد) 10311387 توين 20 Coolaber (الصين) CT11551-100 مل طبق ثقافة ثيرموفيشر (Amercia) 150326 مضخة فراغ ليبولد د25 ب إبرة تشريح FST 26000-35 حاضنه ميمرت باك 313