نظام مراسل الفيروسات المؤتلف في المختبر للكشف عن العدوى الفيروسية

الملخص

المصدر: Nishitsuji، H.، et al. تطوير نظام مراسل فيروس التهاب الكبد B لمراقبة المراحل المبكرة من دورة النسخ المتماثل. J. Vis. Exp. (2017).

يوضح هذا الفيديو تقنية في المختبر للكشف عن عدوى فيروس التهاب الكبد B (HBV) عبر نظام الإبلاغ عن فيروس التهاب الكبد B المؤتلف. عند إصابة الخلايا المضيفة ، يعبر الجينوم الفيروسي المؤتلف عن إنزيم مراسل لوسيفيراز ، الذي ينتج تلألؤا بيولوجيا عند أكسدة ركيزته - مما يساعد على اكتشاف العدوى الفيروسية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. إنتاج فيروس التهاب الكبد B المؤتلف الذي يشفر بروتين المراسل

1. تحضير خلايا HepG2
   1. تحضير وسط زراعة الخلايا (وسط النسر المعدل من Dulbecco أو DMEM) مكمل بمصل الأبقار الجنيني بنسبة 10٪ (FBS) ، و 100 وحدة / مل من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ، و 100 وحدة / مل من الأحماض الأمينية غير الأساسية).
   2. صفيحة 4 × 10⁶ خلايا HepG2 في طبق مغطى بالكولاجين مقاس 10 سم في 10 مل من وسط المزرعة في اليوم السابق للتعداد. احتضان خلايا HepG2 عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
      ملاحظه: عندما يتم طلاء ما يقرب من 4 × 10⁶ خلايا HepG2 في طبق مغطى بالكولاجين مقاس 10 سم في 10 مل من وسط الاستزراع ، فستكون 70-90٪ ملتصقة في اليوم التالي.
2. تعداء
   1. خلايا HepG2 Transfect مع 5 ميكروغرام من pUC1.2HBV (فيروس التهاب الكبد B) دلتا إبسيلون و 5 ميكروغرام من pUC1.2HBV / NL15 باستخدام كاشف تعداء وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   2. في اليوم التالي ، قم بإزالة وسط الاستزراع وأضف 10 مل من وسط الاستزراع الطازج.
   3. بعد أسبوع واحد من التعدي ، انقل وسط المزرعة الذي يحتوي على فيروس التهاب الكبد B المؤتلف إلى أنبوب 50 مل وانتقل إلى الخطوة 1.3.1. أضف 10 مل من وسط المزرعة الطازجة إلى الطبق الذي يحتوي على الخلايا المنقولة.
      ملاحظه: يتم الحفاظ على إنتاج فيروس التهاب الكبد B المؤتلف لمدة 4 أسابيع. يمكن تخزين وسط الثقافة الذي يحتوي على فيروس التهاب الكبد B المؤتلف عند 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد.
3. تنقية فيروس التهاب الكبد B المؤتلف
   1. قم بإزالة بقايا الخلية من وسط الاستزراع الذي يحتوي على فيروس التهاب الكبد B المؤتلف عن طريق الطرد المركزي (2,300 × جم لمدة 5 دقائق).
   2. مرر المادة الطافية من خلال مرشح غشائي 0.45 ميكرومتر.
   3. أضف حجما متساويا من 26٪ PEG / 1.5 M كلوريد الصوديوم (البولي إيثيلين جلايكول 6000: 130 جم ، كلوريد الصوديوم ، 49 جم ، 1 مل من 0.5 M EDTA (حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك) الرقم الهيدروجيني 8.0 و 5 مل من 1 M HEPES (4-(2-hydroxyethyl) -1-بيبرازين إيثان سلفونيك حمض (درجة الحموضة 7.6 في 500 مل) إلى وسط الاستزراع الذي يحتوي على HBV المؤتلف واخلطه برفق. احتضان طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
   4. جهاز طرد مركزي عند 2,300 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
   5. تخلص من المادة الطافية وقم بإذابة الحبيبات في 0.5 مل من TNE (10 ملي تريس (تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان) ، 50 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 ملي مولار EDTA).
   6. قم بإزالة الحطام عن طريق الطرد المركزي عند 2,300 × جم لمدة 5 دقائق.
   7. قم بتحميل 0.5 مل من TNE المحتوي على فيروس التهاب الكبد B المؤتلف على 0.8 مل من السكروز بنسبة 20٪ في TNE.
   8. جهاز طرد مركزي عند 100,000 × جم لمدة 3 ساعات عند 15 درجة مئوية.
   9. تخلص من أكبر قدر ممكن من المادة الطافية ، واحفظ الحبيبات. أعد تعليقه في 1 مل من DMEM الخالي من المصل لكل 40 مل من وسط الاستزراع.
   10. احتضان طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
   11. قم بالتصفية من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر. تحضير 0.5 مل من الحصص وتخزينها في درجة حرارة -80 درجة مئوية
       ملاحظه: إذا لوحظ تلوث بروتين المبلغ لعينة الفيروس الأصلية ، فقم بتنقية الفيروس عن طريق الطرد المركزي الفائق المتدرج للكثافة بنسبة 5-30٪ من السكروز في TNE عند 100,000 × جم لمدة ساعتين ، أو الطرد المركزي المتوازن بكثافة CsCl من 1.1-1.6 جم / مل عند 150,000 × جم لمدة 50 ساعة.

فئة

2. عدوى فيروس التهاب الكبد B المؤتلف

1. مزرعة خلايا HepG2 تعبر بثبات عن NTCP (بولي ببتيد النقل المشترك للتوروكولات الصوديوم) (HepG2 / NTCP) المعرضة للعدوى بفيروس التهاب الكبد B في DMEM المكملة ب 10٪ FBS ، و 100 U / مل من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ، و 250 ميكروغرام / مل G-418 (جينتيسين) و 100 وحدة / مل من الأحماض الأمينية غير الأساسية عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون
.
2. قبل يوم واحد من الإصابة ، ضع حوالي 5 × 10⁴ خلايا HepG2 / NTCP في صفيحة مطلية بالكولاجين مكونة من 96 بئرا في 0.1 مل من وسط الاستزراع.
3. قم بإذابة فيروس التهاب الكبد B المؤتلف في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى يتبقى القليل من الثلج في القارورة.
4. قم بإعداد الوسط للعدوى عن طريق الجمع بين ما يلي: 10 ميكرولتر من 40٪ PEG8000 في 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، و 2 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، و 10 ميكرولتر من HBV المؤتلف ، و 78 ميكرولتر من وسط الاستزراع الطازج لكل بئر من صفيحة مكونة من 96 بئرا.
5. أضف 100 ميكرولتر من محلول HBV المؤتلف إلى بئر واحد من اللوحة المكونة من 96 بئرا.
6. بعد يوم واحد من الإصابة ، اغسل الخلايا المصابة 3 مرات باستخدام 300 ميكرولتر PBS لكل بئر لإزالة بروتين المراسل الملوث من جزء الفيروس.
7. احتضان الخلايا المصابة في 200 ميكرولتر من وسط المزرعة الذي يحتوي على 2٪ DMSO لمدة أسبوع واحد أو أقل.

< p class = "jove_title" >3. التحليل

1. بعد أسبوع واحد من الإصابة ، اغسل الخلايا المصابة 3 مرات باستخدام PBS.
2. أضف 50 ميكرولتر من محلول التحلل إلى الخلايا المصابة.
3. هز لوحة الثقافة لمدة 5 دقائق ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 2,000 × جم لمدة 5 دقائق.
4. أضف 50 ميكرولتر من ركيزة المراسل إلى لوحة مقياس الإلواء.
5. أضف 20 ميكرولتر من محللة الخلية إلى لوحة مقياس الإضاءة التي تحتوي على ركيزة المراسل. تخلط عن طريق الدوامة لفترة وجيزة.
6. ضع اللوحة في مقياس الإضاءة وابدأ القراءة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات نانو جلو لوسيفيراز المعاينة ريجنت بروميجا N1110 محلول مختلط للبنسلين والستربتومايسين ناكالاي تيسك 09367-34 محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM ثيرمو فيشر العلمي 11140050 DMEM ثيرمو فيشر العلمي 11995065 Opti-MEM I مصل متوسط ثيرمو فيشر العلمي 31985070 100 مم / طبق مغطى بالكولاجين إيواكي 4020-010 كاشف الإرسال Lipofectamine 3000 ثيرمو فيشر العلمي L3000001 البولي إيثيلين جلايكول (PEG) 6000 سيجما ألدريتش 81255 البولي إيثيلين جلايكول (PEG) 8000 سيجما ألدريتش 89510 كلوريد الصوديوم ناكالاي تيسك 31319-45 0.5 مول / لتر محلول EDTA ناكالاي تيسك 06894-14 تريس حمض الهيدروكلوريك ناكالاي تيسك 35434-21 Millex-HP ، 0.45 ميكرومتر ، بولي إيثثر سلفون ، مرشح ميرك ميليبور SLHP033RS ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) سيجما ألدريتش د2650 طبق 96 بئر مطلي بالكولاجين كورنينج رقم 3585 التحلل السلبي 5xBuffer بروميجا [إ1941] GloMax 96 ميكروبليت لومينومتر بروميجا E6501 سكروز ناكالاي تيسك 30403-55 لوحة مقياس الإضاءة Greiner bio-one 655075 HepG2-NTCP1-myc-clone22 - - Nishitsuji، H.، et al. السرطان. العلوم (2015) pUC1.2HBV دلتا إبسيلون - - Nishitsuji، H.، et al. السرطان. العلوم (2015) pUC1.2HBV / NL - - Nishitsuji، H.، et al. السرطان. العلوم (2015) أنبوب 50 مل فيولامو 1-3500-02 الأجسام المضادة ل Myc سيجما ألدريتش [ك3956] HBIG المنظمة اليابانية لمنتجات الدم - IFN-β مشيدة للأدوية 1.49872ه +13 الهيبارين سيجما ألدريتش H3393