التنبيب الفموي لأسماك الزرد البالغة لإدارة المركبات التجريبية

الملخص

المصدر: Ji ، J. ، Thwaite ، R. et al. التنبيب الفموي لأسماك الزرد البالغة: نموذج لتقييم امتصاص الأمعاء للمركبات النشطة بيولوجيا. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو تقنية للتنبيب عن طريق الفم لأسماك الزرد البالغة لإدارة المركبات التجريبية في المريء ومراقبة امتصاصها المعوي. تقدم هذه الطريقة نموذجا قيما لدراسة ديناميكيات الوقاية عن طريق الفم أو المركبات الأخرى داخل الأمعاء.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE

1. الحلول المطلوبة

1. تحضير 150 مجم / لتر (للتخدير) أو 300 مجم / لتر (للقتل الرحيم) من محلول إيثيل 3-أمينوبنزوات ميثان سلفونات (MS-222) بالماء من الحوض حيث يتم الاحتفاظ بأسماك الزرد. املأ خزانا صغيرا ب 1 لتر من محلول التخدير واحتفظ به في حالة تهوية.
2. املأ خزانا صغيرا آخر ب 1 لتر من ماء الحوض بدون MS-222 لاستعادة الأسماك وحافظ على تهويتها.
3. اصنع 50 مل من 1x PBS من محلول مخزون معقم 10x.
4. لتحليل القياس الخلوي / عزل الخلايا المعوية ، قم بإعداد ما يكفي من محلول الكولاجيناز الطازج بنسبة 0.15٪ من النوع الرابع ل 1 مل لكل سمكة من محلول المخزون أو من مسحوق في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco مع 1٪ v / v البنسلين والستربتومايسين (انظر المواد). قم بعمل حصصات (1 لكل سمكة) من 1 مل في أنابيب الطرد المركزي سعة 2 مل. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى 30 دقيقة قبل خطوة التشريح.
5. للفحص المجهري متحد البؤر / تثبيت العينة ، قم بإعداد 50 مل من محلول بارافورمالدهيد (PFA) الطازج بنسبة 4٪ في PBS أو قم بإذابة محلول المرق من فريزر -20 درجة مئوية في غطاء الدخان><. أنذر: PFA سام. يرجى قراءة ورقة بيانات سلامة المواد قبل العمل معها. يجب ارتداء القفازات ونظارات السلامة ، وترك المحاليل دائما داخل غطاء الدخان.

< p class = "jove_title" >2. تجهيز المعدات للتنبيب الفموي

1. ضع ما يقرب من 1 سم من أنبوب سيليكون ناعم على إبرة قفل 31 جم لتغطية طرف الإبرة.
2. قم بقص طرف ماصة مرشح معقمة سعة 10 ميكرولتر (حوالي 2 سم) ، وخذ الطرف الدقيق ، وضعه فوق أنبوب السيليكون كغمد. تأكد من أن الماصة تمتد إلى ما وراء طرف الإبرة لتجنب إصابة.
3. قم بتوصيل الإبرة بحقنة قفل Luer سعة 100 ميكرولتر.
   ملاحظه: اشطفها دائما بالإيثانول ثم المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS ، انظر المواد) جيدا بين العلاجات.

< p class = "jove_title" >3. تحضير تعليق الجسيمات النانوية الفلورية

1. قم بتسمية جسيم البروتين النانوي بإستر Atto-488 NHS (انظر جدول المواد) أو صبغة فلورية مناسبة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
2. أعد تعليق الجسيمات النانوية في محلول بيكربونات الصوديوم 0.1 M بتركيز 2 مجم / مل.
3. قم بإذابة إستر Atto 488 NHS في ثنائي ميثيل سلفوكسيد خال من الأمين (DMSO) عند 2 مجم / مل. احتفظ بكمية 10 ميكرولتر للتحقق من كفاءة وضع العلامات.
4. امزج الجسيمات النانوية وإستر Atto 488 NHS بنسبة مولية 1: 2 (البروتين: صبغة) عن طريق التقليب في الظلام.
5. قم بتدوير الجسيمات النانوية المصنفة عن طريق الطرد المركزي عند 8,000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وقم بإزالة المادة الطافية ، واحتفظ بها للتحقق من كفاءة وضع العلامات.
6. اغسل الجسيمات النانوية الملصقة عن طريق تعليقها في 1 مل من عازلة بيكربونات الصوديوم 0.1 M عن طريق الدوامة وسحب العينات لأعلى ولأسفل. ثم تخلص من المادة الطافية عن طريق الطرد المركزي عند 8,000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر الخطوة 3.6 لمدة 5 مرات.
7. أعد تعليق الحبيبات في 5 مل من 0.1 M عازلة بيكربونات الصوديوم في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل وقم بعمل حصص من الجسيمات النانوية الفلورية في أنابيب الطرد المركزي سعة 1.5 مل (30 حصة). قم بالدوران عند 8,000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المادة الطافية ، وخزنها عند -80 درجة مئوية محمية من الضوء.

< p class = "jove_title" > 4. تخدير الزرد والتنبيب الفموي

1. صيام السمك (>0.5 جم) قبل 48 ساعة على الأقل من التجربة لتفريغ الأمعاء.
2. انقل السمكة (12 سمكة) إلى الخزانات التجريبية (6 لتر) قبل ليلة واحدة من التجربة للسماح بالتأقلم12.
3. دوامة محلول الجسيمات النانوية جيدا (على سبيل المثال ، 2,500 دورة في الدقيقة و 30 ثانية) وارسم الحجم المطلوب من تعليق الجسيمات النانوية (على سبيل المثال ، 20-50 ميكرولتر) في المحقنة المرفقة بالإبرة المحمية.
4. ضع الأسماك في محلول MS-222 المحمول 150 مجم / لتر (انظر القسم 1) حتى تغرق في قاع الخزان ولا تستجيب لقرصة زعنفة الذيل ؛ تستغرق هذه العملية أقل من 5 دقائق.
5. انقل الأسماك المخدرة بسرعة بشبكة إلى صينية بلاستيكية مبللة ، وقم بتوجيه أفقيا لمواجهة الإبرة وابدأ التنبيب الفموي على الفور.
6. ادعم السمكة بعناية بيد واحدة وافتح الفم باليد الأخرى باستخدام الإبرة المحمية. أدخل الإبرة برفق أسفل المريء إلى حوالي 1 سم من فتحة الفم.
   ملاحظه: قد يشعر المشغل بمقاومة طفيفة عندما يمر طرف الماصة بالخياشيم. احرص على عدم توجيه دخول الإبرة كثيرا مما قد يؤدي إلى ثقب الخياشيم.
7. حقن تعليق الجسيمات النانوية ببطء في الأسماك. تأكد من أن التعليق لا يتدفق للخارج عبر الخياشيم أو الفم.
8. قم بإزالة الإبرة برفق وضع السمكة في خزان الاسترداد (انظر القسم 1). عادة ما يستغرق التعافي 1 دقيقة.
9. افحص الأسماك بعناية بحثا عن أي خلل (على سبيل المثال ، النزيف في الخياشيم هو علامة على الانثقاب).
10. بمجرد أن تتعافى الأسماك ، أعيدها إلى الخزانات التجريبية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أنبوب سيليكون داو كورنينج 508-001 القطر الداخلي 0.30 مم والقطر الخارجي 0.64 مم إبرة قفل لور هاملتون 7750-22 31 جم ، محور Kel-F حقنة قفل لور هاملتون 81020/01 100 ميكرولتر ، محور Kel-F طرف ماصة مفلتر نيربي بلس 07-613-8300 10 ميكرولتر إم إس -222 سيجما ألدريتش [إ10521] ذرور 10x PBS سيجما ألدريتش ص 5493 ورق الترشيح مختبر التصفية RM14034252 Atto-488 إستر NHS سيجما ألدريتش هاتف: 41698 DMEM جيبكو 31966 وسط النسر المعدل من Dulbecco ماكسويل RSC ببساطةمجموعة مناديل الحمض النووي الريبي بروميجا إيه إس 1340