تقنية للحث على جفاف العين المناعي الذاتي التجريبي المزمن في الفئران

الملخص

المصدر: Hou، A.، et al. نموذج فأر العين الجافة المناعي الذاتي المزمن مع زيادة في الخلايا التائية للذاكرة المستجيبة في أنسجة مقلة العين.

يوضح هذا الفيديو تقنية للحث على مرض جفاف العين المناعي الذاتي التجريبي المزمن في الفئران. عند حقن مستحلب مساعد للمستضد يحتوي على مستضدات ذاتية ومستضدات غريبة في الفئران على فترات محددة مسبقا ، يحدث التهاب العين المزمن في الفئران المحصنة عن طريق حقن نفس المستضدات في أنسجة سطح العين.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحضير مستخلص الغدة الدمعية

< p class = "jove_content" >ملاحظة: تم تخدير الفئران بالحقن داخل الصفاق من الكيتامين (75 مجم / كجم) والزيلازين (10 مجم / كجم). تم تأكيد التخدير المناسب عن طريق قرص إصبع القدم وقرص الذيل. تم وضع جل العيون على عيون الفئران لمنع الجفاف بعد كل إجراء. تم وضع الفئران المخدرة تحت أضواء الأشعة تحت الحمراء البعيدة للحفاظ على دفء حتى تتعافى تماما. أثناء الإجراءات ووقت التعافي ، تمت مراقبة عن كثب من قبل الباحثين. كانت جميع المواد وأدوات الجراحة معقمة قبل الاستخدام. في نهاية التجربة ، تم القتل الرحيم للفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من البنتوباربيتال (80 مجم / كجم). تم التحقق من القتل الرحيم الكامل عن طريق نقص النبض القلبي وعدم وجود رد فعل وميض عن طريق لمس مقلة العين. تم إيواء الفئران في ظروف قياسية: درجة حرارة الغرفة ، 21-23 درجة مئوية ؛ الرطوبة النسبية ، 30-70٪ ؛ دورة الضوء والظلام ، بالتناوب 12 ساعة (7 صباحا إلى 7 مساء).

1. ضع إناث فئران Sprague-Dawley التي تم القتل الرحيم لها (تتراوح أعمارها من 8 أسابيع إلى 16 أسبوعا) بشكل مسطح ، مع وضع أذن واحدة على الطاولة والأخرى متجهة لأعلى. قم بعمل شق 10 مم متفوق أدنى تحت الأذن المكشوفة باستخدام مقص زنبركي. قم بإزالة الغدة الدمعية عن طريق تشريحها من النسيج الضام المحيط ومن قناة التصريف.
   1. قم بتخزين الغدد في درجة حرارة -80 درجة مئوية لحين الحاجة. قم بإذابة الغدد على الجليد. افرم ناعما قدر الإمكان على الثلج بالمقص. أضف 150 ميكرولتر من PBS مع 1x مثبط البروتياز لكل غدة دمعية.
2. صوتنة العينات على الجليد لمدة 5 دقائق عند 20 كيلو هرتز مع ضبط الصوتنة على 10 ثوان ، و 10 ثوان عند 30٪ السعة. الطرد المركزي العينات الصوتية لمدة 20 دقيقة عند 13,000 × جم و 4 درجة مئوية.
3. ماصة المادة الطافية ونقلها إلى أنبوب جديد. قم بتقطيع المادة الطافية إلى أنابيب سعة 1.5 مل وتخزينها عند -80 درجة مئوية. قم بقياس تركيز البروتين باستخدام مقايسة حمض البيسنكونينيك ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

< p class = "jove_title" >2. تحضير مستحلب وسم السعال الديكي

1. مستحلب
   1. أضف 40 ملغ من المتفطرة السلية المقتولة بالحرارة H37Ra إلى 10 مل من مساعد فرويند الكامل الذي يحتوي على 1 مجم / مل من المتفطرة السلية H37Ra واخلطها جيدا.
      ملاحظه: يحتوي المساعد النهائي الكامل لفرويند على 5 مجم / مل من المتفطرة السلية H37Ra.
   2. قم بوزن البيضا ، وقم بإذابته في PBS ، وقم بإعداد خليط مستضد يحتوي على 2 مجم / مل من البيضافات و 10 مجم / مل من مستخلص الغدة الدمعية. بهدف الحصول على حجم حقن يبلغ 200 ميكرولتر لكل ، قم بإعداد خليط رئيسي بناء على أعداد.
   3. انقل مساعد فرويند غير المكتمل أو مساعد فرويند الكامل إلى أنبوب سعة 50 مل ، مما يضمن أن حجم المادة المساعدة لخليط المستضد بنسبة 1: 1. أضف خليط المستضد قطرة قطرة إلى العامل المساعد أثناء الدوامة بأعلى سرعة حتى لا يؤدي ذلك إلى الانسكاب. استمر في الدوامة لمدة 5 دقائق بعد إضافة كل المستضد.
   4. انقل المستحلب إلى حقنة سعة 5 مل واربطه بحقنة أخرى سعة 5 مل من خلال موصل حقنة. ادفع المستحلب من حقنة إلى أخرى لخلطها.
      ملاحظه: يكون المستحلب جاهزا إذا بقيت قطرة واحدة ككرة عند وضعها في الماء. يجب استخدام المستحلب أو المستحلب الطازج فقط المخزن طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
2. سم السعال الديكي
   1. أعد تكوين 50 ميكروغرام من سم السعال الديكي في 500 ميكرولتر من الماء لعمل تركيز نهائي يبلغ 100 نانوغرام / ميكرولتر><. ملاحظه: لا تعقيم عن طريق الترشيح ، لأن ذلك سيؤدي إلى فقدان المواد. لا تجمد. يظل هذا المحلول نشطا لمدة 6 أشهر على الأقل عند 4 درجات مئوية.
   2. خفف 100 نانوغرام / ميكرولتر من سم السعال الديكي إلى 3 نانوغرام / ميكرولتر باستخدام PBS. انقل 100 ميكرولتر من سم السعال الديكي المخفف إلى حقنة حقن Luer-lock سعة 1 مل بإبرة 27 جرام.

< p class = "jove_title" >3. تحصين فئران لويس

1. في اليوم 0 ، اخلطي المستحلب عدة مرات. قم بتوزيع 200 ميكرولتر من المستحلب ، الذي يحتوي على 1 مجم من مستخلص الغدة الدمعية و 200 ميكروغرام من البيضا الألبومي في مساعد فرويند الكامل ، في محاقن قفل لور سعة 1 مل مع إبر 27G. حقن المستحلب تحت الجلد في قاعدة ذيول الفئران دون تخدير.
   ملاحظه: لا يحتاج الذيل إلى التسخين المسبق قبل الحقن. يتم تحصين كل فأر ب 1 مجم من مستخلص الغدة الدمعية و 200 ميكروغرام من البيضا البيضاوي في مساعد فرويند الكامل مع 500 ميكروغرام من المتفطرة السلية H37Ra.
2. في اليوم 14 ، قم بحقن 200 ميكرولتر من المستحلب ، الذي يحتوي على 1 مجم من مستخلص الغدة الدمعية و 200 ميكروغرام من البيضا في مساعد فرويند غير المكتمل ، بنفس الطريقة كما في اليوم 0. حقن 300 نانوغرام من سم السعال الديكي في 100 ميكرولتر من PBS داخل الصفاق لكل فأر في نفس اليوم.

< ص class = "jove_title" >4. حقن خليط المستضد في الملتحمة تحت الملتحمة العقدية والغدة الدمعية لتجنيد الخلايا المناعية الخاصة بالمستضد والتسبب في التهاب موضعي

1. احسب كمية مستخلص البيضا والغدة الدمعية بناء على عدد الفئران في التجربة. قم بوزن الكمية المطلوبة من البيضافية وامزجها مع مستخلص الغدة الدمعية المذابة المحضر في الخطوة 1 ، مما يجعل محلول المستضد يحتوي على 1 مجم / مل من البيضافات و 1 مجم / مل من مستخلص الغدة الدمعية.
2. تخدير الفئران بالكيتامين (75 مجم / كغ) والزيلازين (10 مجم / كغ) عن طريق الحقن داخل الصفاق. اضغط على أصابع أصابع الفئران للتأكد من تحقيق التخدير المناسب (أي لا تلاحظ أي حركة سريعة الاستجابة بعد القرصة). حقن 5 ميكرولتر من المستضد في الملتحمة تحت الملتحمة القبية. حقن 20 ميكرولتر من المستضد في الغدة الدمعية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الكواشف كوكتيل مثبط البروتياز سيجما ألدريتش P2714-1BTL بيرس BCA مجموعة فحص البروتين علمي حراري هاتف: 23227 المتفطرة السلية H37Ra بيكتون وديكنسون وشركاه 231141 أكمل مساعد فرويند بيكتون وديكنسون وشركاه 231131 البوبومين سيجما ألدريتش أ 5503-10 جي مساعد فرويند غير مكتمل سيجما ألدريتش F5506-6X10ML سم السعال الديكي سيجما ألدريتش P7208-50UG محلول الصوديوم الفلوريسين Bausch & Lomb المملكة المتحدة المحدودة غير أ معدات سونيكاتور فريق السونيكس خلية الفيبرا المجهر الصغير الرابع مختبرات أبحاث فينيكس غير أ