مجموعة متنوعة من العوامل المساعدة على النمو وبروتينات الخلايا تتفاعل للحث على تحمل مصائر مختلفة من الخلايا خلال التنمية. نحن هنا لشرح استخدام من البيضة استعدادا لمواجهة التفاعلات المحتملة بين مختلف البروتينات في التنمية من خلال وضع حبات الحمص E2.5 على الأجنة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
وضع عامل النمو المغلفه الخرز على أجنة الدجاج المرحلة المبكرة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الأنبوب العصبي يعرب العديد من البروتينات في أنماط محددة خلال spatiotemporal التنمية. وقد تبين أن هذه البروتينات لتكون حاسمة لتحديد مصير الخلايا ، والهجرة الخلية ، وتشكيل الدوائر العصبية. تحريض الخلايا العصبية والعظام تشمل الزخرفة تخلقية البروتين (BMP) ، القنفذ الصوتي (SHH) ، عامل نمو الخلايا الليفية (جمعية جيل المستقبل) ، وبين الآخرين. على وجه الخصوص ، تعبيرا عن نمط Fgf8 هو على مقربة من المناطق معربا عن BMP4 وSHH. هذا النمط هو التعبير بما يتفق مع التفاعلات التنموية التي تسهل الزخرفة في telencephalon.
هنا نقدم مظاهرة البصرية من الطريقة التي يمكن استخدام البيضة في التحضير لاختبار آثار Fgfs في تشكيل الدماغ المقدم. والمغلفة مع حبات من البروتين ، ووضعها في أنبوب العصبي النامية لتوفير التعرض المستمر. لأن يستخدم الإجراء الصغيرة والخرز وضعت بعناية ، فمن مينيملي ويسمح لتوضع حبات عدة داخل أنبوب العصبي واحدة. وعلاوة على ذلك ، فإن الأسلوب يسمح لاستمرار التنمية بحيث يمكن تحليل الأجنة في مرحلة اكثر نضجا للكشف عن تغيرات في التشريح والعصبية في الزخرفة. هذا البروتوكول بسيطة ولكنها مفيدة تسمح للتصوير في الوقت الحقيقي. فإنه يوفر وسيلة لإحداث تغييرات محدودة مكانيا وزمانيا إلى مستويات البروتين الذاتية.
البروتوكول
1. إزالة البيض من الحاضنة
في E2 - 2.5 (17 ~ سانت سمو) ، إزالة البيض وإعدادهم وفقا لذلك. يمكن عملوا على الفور أو إعادتها إلى حاضنة لبضع ساعات. يمكن وضع البيض في درجة حرارة الغرفة بأمان لأكثر من ساعة. البيض يمكن أن تبقى خارج لمدة التلاعب. أحيانا يمكن لهذه يستغرق ساعة أو أكثر.
ملاحظة : يعد من الجلوس في درجة حرارة الغرفة ، وأقل احتمالا أنها من أجل البقاء.
2. إعداد الحبر الهند
- يعد حلا جديدة من الحبر الهند بنسبة 4 ٪ في برنامج تلفزيوني العقيمة.
- حقنة ملء مل 3 مع الحل.
- وضع إبرة قياس 27 ½ ، بوصة على الحقنة.
- باستخدام زوج من المرقأة ، ينحني الإبرة إلى زاوية 90 درجة.
3. فتح البيض وحقن الحبر الهند
- باستخدام زوج من الملقط ، قشر الشريط الى الوراء وفتح النافذة ، وذلك باستخدام تأمين الجانب العكسي للشريط على الجانب الخلفي من البيض.
- دليل الإبرة في الزاوية حتى انها تقع فقط تحت الجنين. وضع الإبرة تحت القرص عائم يؤمن أن الحبر ، والتي هي سامة بالنسبة للجنين ، لن تأتي في الاتصال المباشر.
- تحتاج إلى ضخ الحبر فقط ما يكفي لخلق النقيض مريحة. هذا هو عادة أقل من ربع مل.
4. فتح الأنبوب العصبي
- أخذ مقص تشريح غرامة وقطع غشاء رقيق التي تقع على أعلى ، أو في بعض الأحيان حولها ، والجنين.
- أخذ الزوج من 55 ملقط أو التحقيق التنغستن وفتح الأنبوب العصبي الخلفي من لالأمامي. تأكد من أن فتح هي كبيرة بما يكفي لوضع حبة فيه.
ملاحظة : اعتمادا على العمر ، ويمكن استخدام مسبار التنغستن غرامة أن تفعل الشيء نفسه.
5. استرداد مغلفة الهيبارين - الاكريليك حبة
- باستخدام زوج من 55 ملقط ، والعثور على حبة سليمة في الحل. السماح للحبة تعلق نفسها إلى الطرف ، على مقربة ببطء ملقط.
- إزالة حبة من الحل ، وجعله على رأس أكثر من البيض.
- مرة واحدة خارج حبة من حلها ، فإنه لن يأتي على الأرجح قبالة حتى تم وضعها في ألبومين.
6. وضع حبة
- مرة واحدة وقد تم وضع حبة على رأس المنطقة المستهدفة ، واستخدام مسبار التنغستن لترشدها نحو الدماغ الأمامي أو إصلاحه في الدماغ المؤخر.
- إضافة بضع قطرات من برنامج تلفزيوني باستخدام ماصة 10 ميكرولتر.
7. إغلاق البيض
- إغلاق البيض باستخدام قطعة رقيقة من الشريط لاغلاق النافذة.
- ختم البيض وفقا للبروتوكول الإستعداد ، وهي متاحة على http://jove.com/index/Details.stp؟ID=306 .
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
اعتمادا على البروتينات التي ترغب في استخدامها ، وهناك بروتوكولات مختلفة حول كيفية إعداد الخرز. في هذه التجارب ، ونحن نستخدم الهيبارين - الاكريليك الخرز ، ولكن يمكن استخدامها أيضا افى هلام حبات يكون. لقد وجدنا أن الهيبارين - الاكريليك الخرز هي أسهل للتلاعب في البيئة المائية من زلال البيض. الخرز هي غارقة في 5 لتر من البروتين بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. توضع حبات التحكم في برنامج تلفزيوني العقيمة حتى وقت التنسيب. ميزة في استخدام استعدادا البيضة هو أن الجنين لا يزال على قيد الحياة والحرية في وضع طبيع...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات | |
|---|---|---|---|---|
| البيوض | حيواني | مخصبة، E2-2.5 (~ St. 17 HH) | ||
| حضّانة | Profi-I | Lyon | ||
| حبر الهند | أداة | Higgins | يُحضّر محلول بتركيز 4% في PBS معقم. | |
| PBS معقم | بدلاً من ذلك، يمكن استخدام مزيج من الأجسام المضادة | |||
| حقنة 1ml | ||||
| إبر 27G 1/2 | أداة | BD Biosciences | 305109 | بزاوية 90 درجة |
| ملقط | أداة | World Precision Instruments, Inc. | مقاس 55 | |
| ملاقط مرقئة | ||||
| مقص تشريح | أداة | World Precision Instruments, Inc. | 500086 | من نوع vannas، بطول 8.5cm |
| شريط Parafilm | لإغلاق البيوض | |||
| مسبار تنجستن | أداة | Electron Microscopy Sciences | 62091 | أداة رقم 24. المقبض اختياري. |
المراجع
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies. Jounal of Visualized Experiments. 8, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306 (2007).
- Crossley, P. H., Martinez, S., Ohkubo, Y., Rubenstein, J. L. Coordinate expression of Fgf8, Otx2, Bmp4, and Shh in the rostral prosencephalon during development of the telencephalic and optic vesicles. Neuroscience. 108, 183-206 (2001).
- Alexandre, P., Bachy, I., Marcou, M., Wassef, M. Positive and negative regulations by FGF8 contribute to midbrain roof plate developmental plasticity. Development . 133, 2905-2913 (2006).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
