التصوير في الوقت الحقيقي لكثرة البلعمة الضامة لخلايا الدم الحمراء IgG

الملخص

المصدر: Horsthemke، M.، et al. التصوير ثلاثي الأبعاد بفاصل زمني للبلعمة بواسطة ضامة الفئران. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو فحصا لمراقبة أحداث البلعمة المستقلة لخلايا الدم الحمراء (RBC) بوساطة البلاعم. يتم تحضين كرات الدم الحمراء البشرية ذات الغلوبولين المناعي للفأر G (IgG) مع البلاعم الفأرية ويتم ملاحظتها تحت المجهر متحد البؤر. تبتلع كرات الدم الحمراء بواسطة الضامة عن طريق تكوين كوب البلعمة وتستهدف التحلل الليزوزومي.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.

< p class = "jove_title" >1. بذر الخلايا البريتونية في شرائح القناة

1. بعد سحب تعليق خلية البلاعم البريتونية للفأر لأعلى ولأسفل لتقليل التكتل، يتم تعليق الماصة سعة 100 ميكرولتر في القناة المملوءة مسبقا (الحجم، 100 ميكرولتر) لشريحة قناة مطلية بالألياف الليفرونكتين (قناة 100 ميكرولتر لها أبعاد (الطول × العرض × الارتفاع): 50 مم × 5 مم 0.4 مم).
   1. املأ الغرفة مسبقا عن طريق إضافة 1 مل من وسط RPMI 1640 (Hepes) المكملة بالمصل إلى أحد خزاني شريحة القناة ، وإمالة الشريحة ، ثم شفط الوسط من خزان المصب (الشكل 1).
      1. قم بإزالة فقاعات الهواء غير المرغوب فيها ، أو شرائح الهواء الطويلة ، في القناة عن طريق إضافة 1-2 مل وسط إلى أحد الخزانين ، ووضع غطاء الخزان بإحكام ، ثم ضخ الهواء من خلال ضغط الإبهام الإيقاعي على الغطاء ، وعند الضرورة ، إمالة الشريحة. بعد طرد الهواء ، قم بإمالة الشريحة مع الخزان غير المغطى (والذي يحتوي على وسيط) لأسفل قبل إزالة الغطاء لتجنب امتصاص الهواء مرة أخرى في القناة.
2. احتضان شريحة القناة ، المصنفة بالخلايا ، في غرفة رطبة لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية في حالة عدم وجود ثاني أكسيد الكربون₂ (ثاني أكسيد الكربون₂ غير مطلوب نظرا لأن نظام المخزن المؤقت HCO₃- / CO₂ يتم استبداله ب Hepes). يمكن وضع شرائح القناة بشكل ملائم على رف يحتوي على ثماني شرائح. عادة ، يتم تحضير 6-8 شرائح من ماوس واحد ، على الرغم من إمكانية الحصول على ما يصل إلى 10 شرائح أو أكثر.
3. قم بإزالة الرف واستبدل وسيط RPMI 1640 (Hepes) في كل شريحة بوسط RPMI 1640 الذي يحتوي على البيكربونات ، مع 10٪ مصل بقري للجنين ، بالإضافة إلى البنسلين / الستربتومايسين.
   1. قم بإمالة الشريحة وشفط الوسط أولا من الخزان السفلي ثم من الخزان العلوي. بعد ذلك ، أضف 1 مل من الوسط الجديد إلى أحد الخزانات ، وقم بإمالة الشريحة ، وشفط الوسط من خزان المصب ، بعد أن يتدفق عبر القناة.
   2. بعد خطوة الغسيل هذه (التبادل المتوسط) ، املأ شريحة القناة بإضافة 1 مل وسط إلى أحد الخزانات.
      ملاحظه: خطوات الغسيل باستخدام شرائح القناة بسيطة للغاية وفعالة من حيث تبادل المحلول وإزالة الخلايا غير الملتصقة. لاحظ أن وسط RPMI 1640 (البيكربونات) عادة ما يتم احتضانه مسبقا بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ بين عشية وضحاها لضمان التوازن الحراري ودرجة الحموضة.
4. احتضان الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}. قم بإجراء التجارب في اليوم التالي.

< p class = "jove_title" >2. عزل خلايا الدم الحمراء البشرية

1. في اليوم الثاني (اليوم الثاني من التجارب ؛ بعد الحضانة الليلية للضامة البريتونية المعزولة) ، اجمع 1-2 مل من الدم الوريدي المحيطي من متبرع سليم ، في أنبوب هيبارين. انقل 1 مل إلى أنبوب طرد مركزي دقيق ذو قاع دائري 2.0 مل (بولي بروبلين) ، وجهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 18 درجة مئوية (إعداد تجريبي) ، وقم بإزالة المادة الطافية (البلازما والطبقة المكشوفة).
2. استنشق 100 ميكرولتر من خلايا الدم الحمراء المترسوبة برفق واخلط هذا الحجم 1: 1 مع وسط RPMI 1640 (Hepes) المعدل (الموضح أدناه) في أنبوب طرد مركزي دقيق ذو قاع دائري 2.0 مل. قم بتسمية الأنبوب "1: 1" .
   ملاحظه: يحتوي وسيط RPMI 1640 (Hepes) المستخدم في اليوم 2 (للمقايسات) بعد عزل الخلايا ، بالإضافة إلى 10٪ من مصل الأبقار الجنينية المعطل للحرارة ، والبنسلين (100 وحدة / مل) ، والستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل) ، و 1 ملي مولار N- (2-mercaptopropionyl) glycine (لتقليل السمية الضوئية). فيما يلي ، يشار إلى هذه الوسيلة باسم وسيط RPMI 1640 (Hepes) "المعدل".
3. ماصة 4 ميكرولتر من معلق خلايا الدم الحمراء المخفف 1: 1 إلى وسط RPMI 1640 (Hepes) معدل 2 مل ، ماصة مسبقا في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2.0 مل (كرر هذه الخطوة ، أي إعداد أنبوبين). قم بتسمية كل أنبوب "4: 2000". ضع الأنبوبين "1: 1" و "4: 2000" على الجليد.

< p class = "jove_title" >3. وضع العلامات على غشاء بلازما البلاعم

1. قم بإزالة شرائح القناة المصنفة من حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ واستبدل وسط RPMI 1640 (بيكربونات ) في كل شريحة بوسط RPMI 1640 (Hepes) معدل. بعد ذلك ، ضع الخلايا في غرفة رطبة عند 37 درجة مئوية في حالة عدم وجود CO₂.
   ملاحظه: بعد الحضانة والغسيل طوال الليل ، تتم إزالة معظم الخلايا الليمفاوية من القناة. غالبية الخلايا الملتصقة المتبقية عبارة عن ضامة ، والتي يمكن تحديدها إما شكليا أو عن طريق تلطيخ التألق المناعي باستخدام الجسم المضاد المضاد F4 / 80. حوالي 95٪ من البلاعم البريتونية المقيمة في الفئران إيجابية F4 / 80.
2. تمييع الجسم المضاد F4 / 80 المضاد للفأر المضاد للفأر (مخزن عند 4 درجات مئوية) 1:40 في وسط RPMI 1640 (Hepes) المعدل. خذ شريحة ، وقم بإمالتها ، وقم بتمرير 100 ميكرولتر من خليط الجسم المضاد (قطرة قطرة) في فتحة قناة 100 ميكرولتر للشريحة (انظر الشكل 1). وسط الشفط الذي يتدفق إلى خزان المصب. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية (بيئة رطبة ، بدون ثاني أكسيد الكربون₂). خلال فترة الحضانة ، قم بتسمية خلايا الدم الحمراء البشرية (انظر القسم 5).
   ملاحظه: وكما أشير إليه أعلاه، فإن ثاني أكسيد الكربون₂ غير مطلوب لأن نظام العازلة HCO₃-/CO₂ يستعيض عنه Hepes.
3. بعد 20 دقيقة من وقت الحضانة (يتم خلالها تلطيخ خلايا الدم الحمراء البشرية وتحويلها) ، اغسل الشريحة بإضافة 1 مل من وسط RPMI 1640 (Hepes) المعدل إلى أحد الخزانات وشفط الوسط بعد تدفقه عبر القناة ، مما يسهل عن طريق إمالة الشريحة. أضف 1 مل متوسطا للتخزين قصير المدى أو انتقل إلى تجربة (أي سحب العينات في الجسيمات (خلايا الدم الحمراء النظيرة) وتصوير البلعمة عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر للقرص الدوار بفاصل زمني).

< p class = "jove_title" >4. وضع العلامات على غشاء البلازما لخلايا الدم الحمراء البشرية

1. ابدأ في وضع العلامات على خلايا الدم الحمراء البشرية مباشرة بعد احتضان شريحة من البلاعم بجسم مضاد مضاد ل F4 / 80 ذو علامة فلورسنت خضراء (بعد القسم 3.2). بعد الخلط اللطيف ، خذ 400 ميكرولتر من أحد أنابيب "4: 2000" (انظر القسم 2.3) وقم بتوزيعه في أنبوب طرد مركزي دقيق (قاع دائري) سعة 2.0 مل. اترك وقتا حتى يسخن التعليق إلى حوالي 37 درجة مئوية (انظر الفقرة أدناه). أضف 0.4 ميكرولتر من صبغة غشاء البلازما الفلورية البرتقالية / الحمراء (الحصص المخزنة عند -20 درجة مئوية) ، واخلطها واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق < / > ملاحظه: تعتبر كتلة الألمنيوم الساخنة ، الموضوعة داخل غطاء التدفق الصفحي ، مفيدة لتقليل فقد الحرارة أثناء تحضير الشرائح. يمكن وضع الأنابيب في آبار تجويف كتلة التسخين ويمكن أن تكون لوحة الألمنيوم المنفصلة أو المتكاملة بمثابة مساحة عمل.
2. بعد فترة الحضانة التي تبلغ 5 دقائق ، قم بإعداد خطوة الغسيل الأولى بإضافة 1600 ميكرولتر معدل RPMI 1640 (Hepes) متوسط (لملء أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 2.0 مل).
3. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 18 درجة مئوية (إعداد تجريبي). يجب أن تكون الحبيبات الحمراء المدمجة مرئية على الحائط (أي خارج المركز) في الجزء السفلي من الأنبوب. قم بتدوير الأنبوب بحيث تكون الحبيبات متجهة لأعلى وقم بإزالة كل المادة الطافية بعناية على التوالي (في خطوتين) باستخدام طرف ماصة من 1 إلى 1.5 مل.
4. بعد شفط المادة الطافية ، أضف 2,000 ميكرولتر معدل RPMI 1640 (Hepes) الوسيط ، واخلطه (لإعادة تعليق الخلايا) ، وكرر خطوات الطرد المركزي والشفط الطافي المذكورة أعلاه.
5. أعد تعليق الحبيبات (من غشاء البلازما الملطخ و 2x خلايا الدم الحمراء المغسولة) مع 400 ميكرولتر من RPMI 1640 (Hepes) المتوسط المعدل. قم بتسمية الأنبوب PMS (اختصار لصبغة غشاء البلازما).
   ملاحظه: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام إستر السكسينيميديل لمشتق الرودامين الحساس للأس الهيدروجيني ، والذي يصبح أكثر فلورية بقوة عند درجة الحموضة الحمضية ، لتسمية خلايا الدم الحمراء البشرية. في هذه الحالة ، تعمل شدة التألق أيضا كمقياس لنضج البلعمة بعد استيعاب الجسيمات.

< p class = "jove_title" >5. Opsonization (وضع العلامات) على خلايا الدم الحمراء البشرية باستخدام الغلوبولين المناعي G للفأر (IgG)

1. أضف 1 ميكرولتر من الفأر (IgG2b) أحادي النسيلة (استنساخ HIR2) الجسم المضاد CD235a (1 مجم / مل) (مخزن عند -20 درجة مئوية) إلى الأنبوب المسمى PMS (انظر الأقسام 4.2-4.5) ، الذي يحتوي على خلايا الدم الحمراء البشرية الملطخة بغشاء البلازما المعلقة في وسط 400 ميكرولتر. CD235a (المعروف أيضا باسم الجليكوفورين أ) هو غشاء خاص بسلالة الكريات الحمراء.
2. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 8 دقائق. لاحظ أن تضخم خلايا الدم الحمراء البشرية باستخدام IgG يسبب تراقا (تكتل الخلايا). على الرغم من أن التراص يمكن أن يكون بمثابة مؤشر مرئي للتضييق ، إلا أنه غير مرغوب فيه لتصوير تأثيرات البلعمة المفردة. للتحايل على التراص، قم بخلط معلق الخلية بشكل متكرر (كل 1 دقيقة) باستخدام ماصة متغيرة الحجم 20-200 ميكرولتر مضبوطة على 200 ميكرولتر.
   1. قرب نهاية فترة الحضانة التي تبلغ 8 دقائق ، إذا رغبت في ذلك ، اغسل شريحة البلاعم ، المحتضنة بجسم مضاد مضاد للأشعة F4 / 80 باللون الأخضر المسمى بالفلورسنت ، مع 1 مل معدل RPMI 1640 (Hepes) متوسط. تأكد من خلو كلا خزاني شريحة القناة من الوسط بعد خطوات الغسيل.

فئة

6. تصوير البلعمة لخلايا الدم الحمراء البشرية الملطخة بغشاء البلازما والمغلفة ب IgG

1. بعد الحضانة لمدة 8 دقائق بجسم مضاد مضاد ل CD235a (القسم 5.2) ، معلق ماصة 100 ميكرولتر يحتوي على خلايا دم حمراء بشرية ملطخة بغشاء البلازما و IgG opsoned في قناة شريحة تحتوي على البلاعم المصنفة بجسم مضاد فلورسنت أخضر مضاد F4 / 80 (الخطوة 3). وبالتالي ، تضاف خلايا الدم الحمراء البشرية الفلورية الحمراء IgG إلى الخلايا البلعمية الفلورية الخضراء (الضامة).
2. بمجرد إضافة خلايا الدم الحمراء البشرية ، قم بتركيب شريحة القناة على مجهر متحد البؤر للقرص الدوار (مع ضبط حاضنة المرحلة على 37 درجة مئوية) للتصوير ، على سبيل المثال ، عبر عدسة موضوعية غمر بالزيت 60X / 1.49. ابدأ التصوير في أسرع وقت ممكن ، حيث تبدأ الجسيمات في الاستقرار في غضون دقيقة واحدة < br / > ملاحظه: باستخدام حبات الفلورسنت التي يبلغ قطرها 100 نانومتر ، قمنا بقياس ، من خلال تحليل وظائف انتشار النقاط ، دقة XY من x = 0.22 ميكرومتر ، y = 0.23 ميكرومتر (ليزر 488 نانومتر) و x = 0.27 ميكرومتر ، y = 0.27 ميكرومتر (ليزر 561 نانومتر). ومع ذلك ، لتقليل التبييض الضوئي والسمية الضوئية أثناء التصوير ثلاثي الأبعاد بفاصل زمني للخلايا الحية ، فإننا نعرض الدقة المكانية للخطر باستخدام 2 × 2 binning. يزيد Binning من الحساسية (يحسن نسبة الإشارة إلى الضوضاء) ومعدل الإطارات المسموح به، ولكن على حساب الدقة المكانية.
3. استخدم نظام تركيز بؤري مثالي (أو نظام مشابه) لمنع انحراف التركيز البؤري أثناء التسجيلات. بعد تنشيط نظام التركيز البؤري المثالي، استخدم عنصر التحكم في الإزاحة للتركيز على نتوءات البلاعم الصفيحية مباشرة فوق انزلاق الغطاء (انظر الملاحظة أدناه) لشريحة القناة. يتوافق مستوى التركيز هذا مع Z = 0 ميكرومتر. احصل على مكدسات Z من -1 ميكرومتر إلى +16 ميكرومتر بخطوات 0.8 ميكرومتر ، والتي تصل إلى 22 شريحة Z. يمكن الحصول على مكدسات Z ، على سبيل المثال ، بمعدل 1 مكدس (لكل قناة) كل 15 ثانية ليصبح المجموع 16 دقيقة
   ملاحظه: تعاني فترات التسجيل الأطول من فقدان جودة الصورة ، ويرجع ذلك أساسا إلى التبييض الضوئي. يتم الحصول على مكدسات Z لكل من القناتين: يتم تصوير البلاعم باستخدام ليزر 488 نانومتر (قناة خضراء) ويتم تصوير خلايا الدم الحمراء البشرية باستخدام ليزر 561 نانومتر (قناة حمراء). باستخدام هذا النهج ، يمكن الحصول على طرق عرض مختلفة للبلاعم التي تبتلع خلايا الدم الحمراء البشرية IgG-opsonized في نقاط زمنية مختلفة (على سبيل المثال ، انظر الشكل 2).
   ملاحظه: الإعدادات النموذجية للنظام (مع 2 × 2 binning) هي: القناة الخضراء (20.5٪ ليزر (50 ميغاواط ؛ 488 نانومتر) الطاقة, 101 حساسية (المدى, 0-255), و 200 مللي ثانية وقت التعرض); قناة حمراء (10.5٪ ليزر (50 ميجاوات ؛ 561 نانومتر) طاقة ، حساسية 101 (النطاق ، 0-255) ووقت تعريض 98 مللي ثانية).
   ملاحظه: الجزء السفلي من شريحة القناة عبارة عن بوليمر بنفس سمك غطاء الزجاج # 1.5 ونفس الخصائص البصرية للزجاج ، ولكن ، على وجه الخصوص ، تتمتع المادة بميزة نفاذية الغاز.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: التعامل مع شرائح القناة المغلفة بالفبرونكتين. (أ) تتكون شريحة القناة من خزانين متصلين بقناة بأبعاد 50 مم × 5 مم 0.4 مم. يتم ملء شرائح القناة مسبقا في البداية عن طريق تطبيق 1-2 مل متوسط على أحد الخزانين وإمالة الشريحة. (ب) يمكن وضع الأغطية على الخزانات قبل الحضانة. يمكن استخدام الأغطية بسهولة لضخ فقاعات الهواء غير المرغوب فيها قبل زرع القناة بالخلايا. (ج) يمكن ملء قناة 100 ميكرولتر...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات قسطرة بلاستيكية 24 جرام B Braun Mesungen AG ، ألمانيا هاتف: 4254503-01 تستخدم للغسيل البريتوني محلول الملح المخزن من هانك بدون Ca2+ و Mg2+ ثيرمو فيشر العلمي 14170120 تستخدم للغسيل البريتوني 14 مل أنابيب القاع المستديرة من مادة البولي بروبلين بي دي فالكون 352059 تستخدم لجمع الخلايا البريتونية RPMI 1640 متوسط يحتوي على 20 ملي مولار هيبس سيجما ألدريتش R7388 الأساس الوسيط للفحوصات مصل الأبقار الجنينية المعطل بالحرارة ثيرمو فيشر العلمي 10082139 تستخدم كمكمل لوسائط RPMI 1640 100x البنسلين / الستربتومايسين ثيرمو فيشر العلمي 15140122 تستخدم كمكمل لوسائط RPMI 1640 غرف μ-Slide I المطلية ب Fibronectin Ibidi ، Martinsried ، ألمانيا 80102 شرائح القناة المستخدمة للمقايسات رف μ منزلق (ألومنيوم مؤكسد) Ibidi ، Martinsried ، ألمانيا 80003 رف قابل للتكديس قابل للتعقيم بالهواء الطرق لشرائح القناة RPMI 1640 متوسط يحتوي على بيكربونات سيجما ألدريتش R8758 وسيط للثقافة بين عشية وضحاها N- (2-mercaptopropionyl) glycine سيجما ألدريتش م 6635 زبال أنواع الأكسجين التفاعلية أليكسا فلور 488 الفئران المترافقة (IgG2a) أحادي النسيلة (استنساخ BM8) الجسم المضاد للفأر F4 / 80 ثيرمو فيشر العلمي MF48020 علامة البلاعم الفأرية وملصق غشاء البلازما CellMask البرتقالي ثيرمو فيشر العلمي [ك10045] صبغة غشاء البلازما الفلورية الحمراء إستر السكسينيميديل من phrodo ثيرمو فيشر العلمي P36600 إستر السكسينيميديل التفاعلي مع الأمين من pHrodo الماوس (IgG2b) أحادي النسيلة (استنساخ HIR2) مضاد للإنسان CD235a ثيرمو فيشر العلمي MA1-20893 تستخدم لمعالجة خلايا الدم الحمراء البشرية باستخدام IgG Alexa Fluor 594 المترافق الماعز المضاد للفأر (الثانوي) الجسم المضاد IgG أبكام أب150116 يستخدم لتأكيد ضلاحية خلايا الدم الحمراء البشرية باستخدام IgG للفأر الجسم المضاد للفئران C3b / iC3b / C3c المضاد للفئران Hycult Biotech إتش إتش 1065 تستخدم لتأكيد تبصرة C3b / iC3b لخلايا الدم الحمراء البشرية Alexa Fluor 488 مترافق الماعز المضاد للجرذان IgG المضاد ثيرمو فيشر العلمي أ -11006 يستخدم كجسم مضاد ثانوي لتأكيد التظليل C3b / iC3b نظام تصوير الخلايا الحية UltraVIEW Vox 3D بيركين إلمر ، رودجاو ، ألمانيا نظام المجهر متحد البؤر القرص الدوار مجهر نيكون Eclipse Ti العكسي نيكون، اليابان مجهر مقلوب CSU-X1 ماسح ضوئي للقرص الدوار شركة يوكوجاوا للكهرباء ، اليابان وحدة قرص الغزل Nipkow 14 بت Hamamatsu C9100-50 جهاز مزدوج مشحون بالإلكترون (EM-CCD) كاميرا مبردة بالبلتيير شركة Hamamatsu Photonics Inc. ، اليابان كاميرا EM-CCD لنظام المجهر متحد البؤر للقرص الدوار ليزر الحالة الصلبة 488 نانومتر ، 50 ميجاوات بيركين إلمر ، رودجاو ، ألمانيا مصدر الليزر (488 نانومتر) لنظام المجهر متحد البؤر للقرص الدوار ليزر الحالة الصلبة 561 نانومتر ، 50 ميجاوات بيركين إلمر ، رودجاو ، ألمانيا مصدر الليزر (561 نانومتر) لنظام المجهر متحد البؤر للقرص الدوار