تلطيخ أسيتوكسي ميثيل الكالسيين لتقييم السمية الخلوية الطبيعية بوساطة الخلايا القاتلة تجاه الخلايا السرطانية

الملخص

المصدر: Chava، S. et al. ، قياس السمية الخلوية الطبيعية بوساطة الخلايا القاتلة والهجرة في سياق الخلايا السرطانية الكبدية. J. Vis. Exp. (2020)

يوضح هذا الفيديو فحصا لقياس السمية الخلوية للخلايا القاتلة الطبيعية ضد الخلايا السرطانية باستخدام صبغة Calcein AM. يشير انخفاض عدد الخلايا السرطانية الفلورية بعد الزراعة المشتركة مع الخلايا القاتلة الطبيعية إلى السمية الخلوية الطبيعية بوساطة الخلايا القاتلة تجاه الخلايا السرطانية.

البروتوكول

فئة

1. طريقة مجهرية قائمة على تلطيخ الكالسين AM لقياس السمية الخلوية بوساطة الخلايا القاتلة

الطبيعية

1. زراعة خلايا SK-HEP-1 إلى التقاء 70-80٪. قم بإنشاء معلق أحادي الخلية عن طريق غسل الخلايا أولا ب 5 مل من 1x PBS متبوعا بالحضانة مع 1 مل من 0.25٪ تريبسين-EDTA.
2. خلايا الطرد المركزي SK-HEP-1 في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 1 مل عند 160 × جم لمدة 3 دقائق.
3. أضف 1.5 ميكرولتر من محلول الكالسيين AM (10 ملليمتر) إلى خلايا SK-HEP-1 واحتضنه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. خلايا SK-HEP-1 ذات علامات AM-CALcالسيين بأجهزة الطرد المركزي عند 160 × جم لمدة 3 دقائق في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل.
4. اغسل الخلايا مرتين باستخدام 5 مل من 1x PBS لإزالة صبغة الكالسين AM الزائدة.
5. في موازاة ذلك ، تعمل خلايا الطرد المركزي NK92MI عند 160 × جم لمدة 3 دقائق في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل. اغسل حبيبات الخلية مرة واحدة باستخدام 5 مل من 1x PBS وأعد تعليقها في 5 مل من وسط الخلية NK92MI.
6. عد خلايا SK-HEP-1 المسماة بالكالسين AM وخلايا NK92MI باستخدام مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا الآلي.
7. قم بتعليق خلايا SK-HEP-1 في وسط الثقافة عند 1 × 10⁵ خلايا / مل وخلايا NK92MI عند 1 × 10⁶ خلايا / مل في وسط الخلية NK.
8. صفيحة الكالسين المسماة AM خلايا SK-HEP-1 (الخلايا المستهدفة) (1 × 10⁴/100 ميكرولتر / بئر) مع خلايا NK92MI (خلايا المستجيب) (1 × 10⁵/100 ميكرولتر / بئر) (1:10 الهدف: نسبة المستجيب) لكل بئر في آبار ثلاثية النسخ في لوحة 96 بئر.
9. احتضان الألواح المكونة من 96 بئرا عند 37 درجة مئوية في جو من 95٪ هواء و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 4 ساعات. بعد الحضانة ، التقط صورا مضانية للخلايا المسماة بالكالسيين AM باستخدام مجهر مضان بتكبير 10x. التقط ما لا يقل عن 10 حقول مختلفة لكل تكرار لكل حالة علاجية.
10. حدد عشوائيا 10 صور لكل نسخ متماثل وعد الخلايا المستهدفة المصنفة إيجابية الكالسين AM المحتضنة مع أو بدون خلايا NK92MI. احسب النسبة المئوية للسمية الخلوية باستخدام الصيغة أدناه.
    
    ملاحظه: كعناصر تحكم ، استخدم الخلايا المستهدفة بدون خلايا NK92MI والخلايا المستهدفة المحللة بالكامل كتحكم كامل في التحلل. للتحلل الكامل ، احتضان الخلايا في 0.5٪ Triton X-100 لمدة ساعة واحدة (20 ميكرولتر من 5٪ Triton X-100 في 200 ميكرولتر من وسائط الاستزراع).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات صبغة الكالسين AM سيجما ألدريتش 17783 DMEM جيبكو 11965-092 مصل الأبقار الجنينية جيبكو 26140079 مصل الحصان جيبكو 16050114 خلايا NK92MI ATCC CRL-2408 محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS) سيجما ألدريتش ص 4417 خلايا SKHEP-1 ATCC إتش تي بي-52 محلول Trypsin EDTA جيبكو 25200056