قياس هجرة الخلايا القاتلة الطبيعية استجابة للمنبهات الكيميائية

الملخص

المصدر: Chava، S.، et al. قياس السمية الخلوية الطبيعية بوساطة الخلايا القاتلة والهجرة في سياق الخلايا السرطانية الكبدية. J. Vis. Exp. (2020).

يوضح هذا الفيديو طريقة لدراسة هجرة الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) من خلال نظام إدخال غشاء مسامي استجابة للجاذبات الكيميائية. تتيح هذه الطريقة التحليل الكمي لهجرة الخلايا القاتلة الطبيعية باستخدام قياس التدفق الخلوي.

البروتوكول

1. فحص ترحيل الخلايا NK

1. قم بزراعة خلايا NK92MI وخلايا الطرد المركزي عند 160 × جم لمدة 3 دقائق في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 15 مل.
2. اغسل حبيبات الخلية مرتين باستخدام 5 مل من 1x PBS وأعد تعليق الخلايا في 3 مل من وسط الخلية NK92MI الخالي من المصل. عد خلايا NK92MI باستخدام مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا الآلي.
3. خلايا اللوحة NK92MI (2.5 × 10⁵ خلايا / 100 ميكرولتر / بئر) في المقصورة العلوية للغرفة القابلة للاختراق (إدراج قطره 6.5 مم وحجم المسام 5 ميكرومتر).
4. في الحجرة السفلية ، أضف 0.6 مل من الوسط الخالي من المصل الذي يحتوي على مادة ليتم اختبارها بحثا عن خصائص الجاذبية الكيميائية للخلايا القاتلة الطبيعية (على سبيل المثال ، الوسط المكيف ، والكيموكينات ، والسيتوكينات).
   ملاحظه: عند تحضير الوسط المكيف ، استخدم وسط مصل منخفض بدون مصل مضاف للتخلص من التداخل من بروتينات المصل في مقايسة الهجرة.
5. احتضان الغرف المكونة من 24 غرفة نفاذية جيدا عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. بعد 4 ساعات ، اجمع خلايا NK92MI غير الملتصقة والمهاجرة من الغرفة السفلية وانقلها إلى أنابيب فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) لمزيد من التحليل.
   ملاحظه: قد يختلف وقت الثقافة اعتمادا على نوع الخلايا المستهدفة ، بالإضافة إلى كمية وحركية الكيموكينات التي تنتجها الخلايا المستهدفة. لذلك ، يجب تحديد هذه المرة تجريبيا لكل نوع من أنواع الخلايا والكيموكين والتجربة.
6. أضف عددا محددا مسبقا من حبات العد لقياس التدفق الخلوي بحجم 50 ميكرولتر لكل أنبوب يحتوي على خلايا NK المهاجرة. قم بتقييم حجم 300 ميكرولتر / تعليق خلية البئر باستخدام أي مقياس تدفق خلوي قادر على العد الآلي للخلايا المستندة إلى FACS.
   ملاحظه: امزج أو امزج حبات العد لقياس التدفق الخلوي جيدا في كل مرة قبل الاستخدام لضمان استخدام عدد ثابت من الخرز لتقليل التباين التجريبي. يوصى بسحب العينات العكسي باستخدام حبات العد للحفاظ على الدقة. استخدم فقط الخلايا القاتلة الطبيعية وعد الخرز لقياس التدفق الخلوي كعناصر تحكم في تحليل FACS. يوصي المؤلفون بقراءة ما لا يقل عن 10,000 حبة + خلايا NK مجتمعة ، وهو مبلغ نجح بشكل جيد. ومع ذلك ، قد يختلف هذا الرقم حسب الظروف التجريبية. لذلك ، يجب تحديد العدد المشترك للحبات + الخلايا القاتلة الطبيعية تجريبيا لكل نوع من أنواع التجارب. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم إجراء تجارب باستخدام ثلاث نسخ بيولوجية لتحقيق نتائج ذات دلالة إحصائية وحساب التباين بين عدد الخلايا المختلفة.
7. احسب العدد المطلق لخلايا NK92MI التي تم ترحيلها باستخدام هذه الصيغة:
   
   حيث A = عدد الخلايا ، B = عدد الخرز ، C = عدد الخرزات المخصصة للدفعة (عدد حبات العد لقياس التدفق الخلوي / 50 ميكرولتر ؛ في هذا المثال 49،500) ، و D = حجم العينة (μL).
   ملاحظه: إذا تم استخدام 300 ميكرولتر من حجم العينة (الخلايا المهاجرة) لتحليل FACS مع 50 ميكرولتر من حبات العد لقياس التدفق الخلوي ، فإن العدد المطلق للخلايا المهاجرة = 1,700 خلية / 3,300 حدث حبة × 49,500 حبة / 300 ميكرولتر = 84.975 خلية / ميكرولتر. يجب تصحيح الحساب إذا تم تخفيف العينة أو إذا تم استخدام حجم مختلف من حبات عد FACS.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات حبات العد المطلق ثيرمو فيشر العلمي سي 36950 خلايا NK92MI ATCC CRL-2408 خلايا SKHEP-1 ATCC إتش تي بي-52 غرف نفاذية عبر البئر كوستار 3241 أوبتي-ميم جيبكو 31985070 محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS) سيجما ألدريتش ص 4417 ألفا ميم سيجما ألدريتش م 4256